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金银花nrDNA ITS区聚合酶链反应条件的研究
目的:金银花nrDNA ITS区序列G+C含量为68%,用常规的PCR方法扩增效果差.本研究通过改变扩增程序及使用改性剂的方法显著提高了金银花nrDNA ITS区的扩增效率.方法:分别从金银花叶及药材中提取总DNA,通过优化扩增条件,对nrDNA ITS区进行扩增,并比较了两种优化方法的差别及适应性.方法1:提高变性温度至97℃;方法2:添加混合改性剂(DMSO 4%-甘油10%).结果:与方法1相比,方法2可降低变性温度5 ℃,升高退火温度9 ℃,降低镁离子浓度至0.5 mmol/L,降低Taq DNA聚合酶用量至0.1 U(30 μl体系),PCR产物量显著提高,且可消除植物DNA粗提物中杂质的干扰.结论:通过提高退火温度及添加改性剂可克服高G+C含量金银花nrDNA ITS区序列扩增的困难,该方法的建立有助于解决植物来源DNA模板的PCR扩增问题.
关键词： 金银花 nrDNA ITS区 高G+C含量 PCR扩增 反应条件优化 -
PCR-RFLP检测Apo CⅢ基因T-455C多态性的反应条件优化
目的:探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)反应体系中各种成分的优化,建立检测载脂蛋白CⅢ(Apo CⅢ)T-455C多态性的方法.方法:采用PCR-RFLP检测ApoCⅢ基因T-455C多态性,同时通过对参与反应体系的成分,在一定范围内设置不同的浓度或参数组,进行正交试验和单因素逐项试验,观测各成分在不同条件下对结果的影响.结果:Apo CⅢ基因检测到3种基因型.PCR反应体系中不同模板含量、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、退火温度和酶切体系中PCR产物量、内切酶量、酶切时间等对反应结果均有不同程度的影响.结论:该研究建立的PCR-RFLP体系检测Apo CⅢ基因T-455C多态性技术,是一种高效快速、简单敏感、准确可靠的分析方法,适合常规实验室开展.
