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miR-15a/16-1基因敲除小鼠的鉴定及其脾脏免疫细胞频率分析
目的:探讨miR-15a/16-1基因敲除小鼠的繁育与子代鼠的鉴定,及其脾脏免疫细胞频率.方法:从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定.miR-15a/16-1基因敲除小鼠眼眶取血,用动物血液分析仪进行全血细胞分析.采用流式细胞仪分析miR-15a/16-1基因敲除小鼠脾脏中免疫细胞频率.结果:miR-15a/16-1+/+、miR-15a/16-1+/-、miR-15a/16-1-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律.流式结果显示,miR-15a/16-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,CD19+、NKG2D+细胞增多,其余无明显差异.全血细胞分析结果显示淋巴细胞增多.结论:实验所用PCR方法可以鉴定miR-15a/16-1-/-小鼠;miR-15a/16-1-/-小鼠的获得为进一步探究miR-15a/16-1的作用提供了较理想的动物模型;敲除miR-15a/16-1基因,小鼠脾脏CD19+、NKG2D+细胞增多.
关键词： miR-15a/16-1 基因敲除小鼠 免疫功能 全血细胞分析 -
miR-15a/16-1慢病毒表达载体的构建及鉴定
目的:构建miR-15a/16-1过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定、滴度测定与感染靶细胞.方法:利用PCR法钓取miR-15a/16-1序列片段;将目的基因miR-15a/16-1克隆到慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定并大量抽提;利用脂质体将重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRey、pVSV-G共转染293T细胞包装产生慢病毒.收集病毒悬液梯度稀释,感染293T细胞进行病毒滴度检测;将所得慢病毒感染靶细胞.结果:酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为1×109 TU/ml,对照组病毒滴度为2×109 TU/ml.慢病毒成功感染靶细胞,其转染效率可达到80％左右.结论:成功构建miR-15a/16-1慢病毒表达载体,可获得高效miR-15a/16-1的慢病毒颗粒.
关键词： miR-15a/16-1 慢病毒 293T细胞 绿色荧光蛋白
