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小鼠PNPLA7敲降重组腺病毒的构建及其生物学功能的初步研究
目的:构建小鼠PNPLA7基因的敲降重组腺病毒,检测PNPLA7敲降重组腺病毒对小鼠肝脏PNPLA7蛋白的敲降效率及对肝脏甘油三酯含量的影响.方法:将对照siNC以及敲降PNPLA7的siRNA设计为shRNA并插入到pshuttle-CMV-silence穿梭质粒中,挑选克隆并测序鉴定,测序成功后将质粒进行PmeⅠ线性化,转入含有腺病毒骨架pAdeasy的BJ5183感受态细胞中进行同源重组,重组成功后的质粒经Pac Ⅰ线性化转染293A细胞进行腺病毒包装,得到Ad-shNC对照腺病毒以及Ad-shPNPLA7敲降腺病毒.通过尾静脉注射腺病毒7d后根据免疫印迹实验检测小鼠肝脏中PNPLA7敲降效率,同时利用Folch提脂方法提取并检测小鼠肝脏中甘油三酯含量.结果:成功获得对照腺病毒Ad-shNC以及敲降腺病毒Ad-shPNPLA7.通过尾静脉注射进行小鼠肝脏PNPLA7敲降,结果显示Ad-shPNPLA7腺病毒可成功降低PNPLA7的蛋白表达,敲降PNPLA7后引起肝脏甘油三酯含量上调.结论:小鼠PNPLA7的敲降腺病毒构建成功,敲降PNPLA7引起肝脏中甘油三酯含量升高.
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稳定表达小鼠PNPLA7的Huh7细胞系的构建
目的:构建稳定表达小鼠PNPLA7-Flag蛋白的人类肝癌细胞Huh7细胞系,观察小鼠PNPLA7在Huh7细胞中的过表达以及对Huh7细胞脂质含量的影响.方法:构建pCMV6-PNPLA7-Flag真核表达载体,应用脂质体转染技术将该质粒导入Huh7细胞,随后通过G418筛选稳定表达的细胞系,运用Western blot方法检测PNPLA7蛋白表达;并通过油酸处理及油红染色观察过表达PNPLA7蛋白对Huh7细胞中脂质含量的影响.结果:成功获得2株稳定过表达PNPLA7-Flag的Huh7细胞系;Huh7细胞中过表达PNPLA7蛋白,在油酸处理后细胞内脂滴含量减少.结论:稳定表达小鼠PNPLA7的Huh7细胞系构建成功;小鼠PNPLA7在Huh7细胞中的表达会引起细胞中脂质含量减少,从而为后续研究PNPLA7蛋白在脂代谢通路的功能及机制提供可靠的细胞模型.
