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非编码 RNA AsrC 对巨噬细胞中伤寒沙门菌生存能力的影响
目的：研究伤寒沙门菌非编码 RNA AsrC 对其在巨噬细胞中生存能力的影响及机制。方法：用 AsrC 高表达菌株和空质粒对照株分别感染巨噬细胞12，24 h，检测伤寒沙门菌在感染细胞中的生存能力；qRT-PCR 检测 asrC、rseC、rpoE mRNA 的表达水平；蛋白质印迹检测自噬标志蛋白 LC3的表达。结果：与空质粒对照株相比，AsrC 高表达菌株感染巨噬细胞12，24 h 后在巨噬细胞中的生存能力明显下降（P 均＜0．01），asrC mRNA 表达水平增加（P 均＜0．05），对侧靶基因 rseC mRNA 的表达水平增高（P 均＜0．05），而 rpoE mRNA 的表达水平无明显变化（P ＞0．05）；AsrC高表达菌株自噬标志蛋白 LC3的表达与空质粒对照株间的差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论：伤寒沙门菌非编码RNA AsrC 高表达可降低其在巨噬细胞中的生存能力，可能与自噬无直接关系。
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布鲁氏菌非编码小RNA BSR1526突变株与过表达株的构建及毒力研究
目的 为探讨非编码小RNA BSR1526在布鲁氏菌胞内生存中的作用,构建BSR1526突变株与过表达株并分析它们在模拟胞内环境和小鼠体内的存活能力.方法 首先采用Northern blot和RT-PCR验证布鲁氏菌16M在体外刺激条件中BSR1526的转录;然后采用融合PCR构建BSR1526缺失株;将BSR1526插入到质粒pBBR1-MCS4中,电转入16M中构建过表达株16M-BSR1526;后分析BSR1526缺失株和过表达株在模拟胞内环境以及小鼠体内的存活力.结果 BSR1526在布鲁氏菌16M中存在转录,且在不同刺激条件下转录水平不同.BSR1526缺失或过表达影响了布鲁氏菌16M在体外的生长能力,缺失后在热应激、氧化压力及酸性环境下的生存能力下降,在小鼠脾脏内的细菌数量显著下降,表明BSR1526影响了布鲁氏菌的毒力.结论 非编码小RNA BSR1526影响着布鲁氏菌16M在胞内生存能力,缺失BSR1526后布鲁氏菌16M抵抗外界不良环境的能力下降,同时在小鼠体内的毒力下降.
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结核杆菌CRISPR-associated Csm4(Rv2820c)诱导iNOS表达对耻垢杆菌胞内存活的影响
目的 研究Csm4蛋白在重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,MS)中的表达及其影响胞内存活的机制.方法 PCR扩增Csm4基因,构建重组pMV261-Csm4穿梭表达质粒,将重组质粒和空白质粒电穿孔进MS生成重组菌MS_Csm4和对照重组菌MS_V,采用Western blot对重组菌Csm4蛋白表达进行检测.体外培养观察MS Csm4和MS_V生长曲线,并检测活性氮、活性氧环境下的集落形成单位(CFU)变化.MS_Csm4和MS_V重组菌感染人源巨噬细胞THP-1,计数CFU反映胞内存活,实时荧光定量PCR检测诱导性一氧化氮合酶基因(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达.硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO)释放指标.结果 Csm4蛋白在MS Csm4中成功表达,且其表达不影响MS_Csm4的生长情况;MS_Csm4在体外活性氮、氧环境中CFU下降,与MS_V相比,差异有统计学意义(P＜0.05);重组菌MS_Csm4作用于THP-1细胞后诱导iNOS表达上调,促进NO的释放以及减少胞内生存,与MS_V相比,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重组菌MS_Csm4不能耐受体外活性氮、氧压力环境,可诱导宿主细胞iNOS表达上调,促进NO释放,从而影响其胞内生存能力.
