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聚焦电层析分离牛血清白蛋白和牛血红蛋白
本文借鉴聚焦层析的原理,研究聚焦电层析分离牛血清白蛋白和牛血红蛋白的方法.在充填阴离子交换葡聚糖凝胶DEAE-Sephadex A-50的柱中加入pH 5.7缓冲液平衡,再加入pH 3.0缓冲液形成pH梯度.在柱的两端施加电场,正极在上端,负极在下端.蛋白质在pH梯度内移动时,所带电荷发生变化,所受电场力也改变,移动速度的差异增大,牛血清白蛋白和牛血红蛋白可以完全分离,回收率为90%以上.操作时要注意调节pH梯度范围,以避免蛋白质沉淀析出.这种方法简便,价廉,适用于分离等电点不同的蛋白质.
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人D-二聚体分离纯化及鉴定
目的 分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原.方法 以凝血酶、凝血因子Ⅻ等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层析和聚焦层析,分离纯化得到D-dimer.采用免疫比浊法测定D-dimer 含量、染料结合法测定纯化蛋白含量,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察D-dimer的纯化情况,Weston Blot法确认D-dimer的存在.结果 制备得到的FDP SDS-PAGE图谱显示有多条蛋白条带,1条分子量为180 ～250kD蛋白条带在Western Blot图谱中显示可以被D-dimer单克隆抗体特异性地识别.FDP经Sephacry S-300凝胶层析和聚焦层析后得到纯度较高的D-dimer(n=3):总蛋白含量比为(77.82±7.98)％,蛋白回收率(25.27±6.35)％;SDS-PAGE图谱显示:经过两步层析得到的终产物为分子量180～250 kD的蛋白;Westem Blot证实:经过Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析处理,终得到分子量为180～250 kD的终产物可被D-dimer单克隆抗体特异性识别.结论 采用Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析能够分离纯化获得较高纯度的D-dimer,可作为制备D-dimer单克隆抗体的抗原.
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聚焦层析法分离人血清载脂蛋白CⅢ亚型
用密度梯度超速离心法,从混合人血清中分离极低密度脂蛋白,经脱脂后再进行聚焦层析分离其中的载脂蛋白.获得的纯品载脂蛋白CⅢ1和CⅢ2经等电聚焦电泳均呈现一条带.生物活性的细胞学实验鉴定发现,纯化载脂蛋白CⅢ能抑制培养HepG2细胞对标记极低密度脂蛋白的提取.聚焦层析方法简便,一次上样量大,速度快,分离效果好,还可同时获得载脂蛋白CⅠ,CⅡ和E,是分离纯化脱脂极低密度脂蛋白中载脂蛋白的较好方法.
