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RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究
目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用.方法构建pSuper质粒,化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸,克隆进pSuper的pol III HI启动子的下游,重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒,并转染入骨肉瘤MG63细胞,Western blot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化.结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序,证实成功构建了KDR siRNA表达质粒,转染入细胞后,有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达.结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达,为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础.
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抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建
目的构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体.方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游,获得重组pSUPER-H1质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定.结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌,经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点,经测序鉴定,表明序列完全一致.结论重组pSUPER-H1载体的成功构建,为进一步研究神经生长因子活性打下基础,同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法.
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抑制血管内皮生长因子表达的pSUPER-H1 RNA干扰系统的构建
目的构建抑制血管内皮生长因子(VEGF)活性的小干扰RNA表达载体.方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒,化学合成3对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列,各64个碱基,退火、克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游,获得重组pSUPER-H1-VEGF质粒,转化感受态大肠杆菌,挑选阳性克隆,抽取重组质粒,EcoRⅠ、HindⅢ双酶切电泳、测序鉴定.结果重组质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析,表明64个碱基的核苷酸序列成功插入到预计位点,经测序鉴定,序列完全一致.结论重组pSUPER-H1-VEGF载体成功构建,开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法.
