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必特螺旋霉素的萃取特性及杂质的选择性分离
在必特螺旋霉素萃取过程中,考察了萃取时间、水酯相比和pH值对必特螺旋霉素各组分以及弱极性杂质分离的影响,并分析了异戊酰螺旋霉素Ⅲ和弱极性杂质的分配系数.结果表明,两者的分配系数随pH值的增大而逐渐趋于零;调节萃取pH值为4.4,弱极性杂质的去除率为40.6％,同时异戊酰螺旋霉素Ⅲ含量大于30％.
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分离纯化过程中温度和pH对必特螺旋霉素稳定性的影响
考察了不同温度下必特螺旋霉素在磷酸盐缓冲液和发酵液中的稳定性,以及在碱作用下必特螺旋霉素于水酯两相中的稳定性,并分析水相pH对其组分的影响.结果表明,必特螺旋霉素对热稳定;对pH敏感,适范围为pH4.5～7.5;水酯两相接触时,必特螺旋霉素在碱的作用下易降解,因此萃取和静置分层应在1h内完成.
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剪切力对必特螺旋霉素发酵的影响
目的 考察剪切力对必特螺旋霉素发酵的影响.方法 考察摇瓶发酵过程中玻璃珠数量、添加玻璃珠时间及不同发酵阶段添加玻璃珠对发酵的影响.50 L发酵罐上,通过改变搅拌速度调整对菌体的剪切力,并考查不同发酵阶段剪切力对发酵的影响.结果 随着玻璃珠数的增加,菌体浓度和必特螺旋霉素产量下降明显;48 h时添加玻璃珠对必特螺旋霉素合成有促进效果,效价提高8%,且菌体浓度变化不大.发酵前期(0～48 h)和发酵后期(72～96 h),过强的剪切力会对发酵产生不利的影响.在50 L发酵罐上,不同发酵阶段调整剪切力,使发酵产物单位数比对照提高1 6.7%.结论 剪切力对必特螺旋霉素发酵有显著影响.
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中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基
将克隆自卡波霉素产生菌的4″-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus F-21的染色体上,构建成一株稳定的生物工程菌WSJ-1-195,它产生的一组以4″-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素.针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基,所以本文顺序通过部分因子析因设计法、速上升实验、中心组合实验,并利用统计学软件SAS V8对实验数据进行分析,确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成,为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础.经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg/ml提高到1880μg/ml.
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必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究
曾利用同源重组技术构建了稳定的必特螺旋霉素基因工程菌.本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长,糖、氮源利用及发酵效价增长情况考察了必特螺旋霉素基因工程菌的发酵过程,研究了发酵过程摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、溶解氧(DO)等在线参数的变化,着重研究了不同溶氧水平对必特螺旋霉素发酵的影响.结果表明溶氧水平尤其是发酵前期溶氧水平对必特螺旋霉素发酵影响至关重要,前期临界氧浓度应控制在25%左右.本研究为必特螺旋霉素发酵放大工艺研究提供了依据.
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新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变
本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果.以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticus NBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选.辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120s.每次辐射5s后,冰上快速冷却20s再照射,并将照射时间累计.以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率.结果 表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60s时致死率达到92.55%.微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,佳辐射时间为50s.初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%.终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticus NBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化.
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统计学法优化必特螺旋霉素发酵培基养
利用Plackett-Burman设计法析出影响必特螺旋零素效价的四个显著的因素,以Box-Behnken设计法及响应面分析法确定了主要因素的佳浓度,即鱼粉22.8g/L,酵母粉2.44g/L,CoCl2 9.25mg/L,NaCl 9.13g/L,此时必特螺旋霉素效价为2245μg/ml.新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96h分别达到2380μg/ml和54%,比原配方分别提高了53%和20%.
关键词： 必特螺旋霉素 Plackett-Burman设计 响应面法 发酵培养基 -
亮氨酸对必特螺旋霉素发酵组分的影响
本文针对必特螺旋霉素发酵主要组分异戊酰基螺旋霉素以及异戊酰基螺旋霉素Ⅲ的提高,在摇瓶培养基试验中,通过一次性添加与分批添加终浓度为15.4mmol/L的亮氨酸,发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变,而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素Ⅲ分别由对照的31.1%和12.0%提高至46.9%和19.5%.通过分析发酵过程的有机酸以及氨基酸的变化规律,讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理,同时在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸添加效果进行了验证试验,结果表明,发酵液必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ在96h分别提高至59.91%和21.45%.
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Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响
在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响,证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用.实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸,发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异,而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍.添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快,达到1.0g/(L·h),胞内丙酮酸积累,丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%,柠檬酸合成酶活性降低41%,发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象,终效价比对照高出45.3%,而总异戊酰组分则降低了23%,其他酰化组分降低了39.6%;添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%,柠檬酸合成酶活性降低了47%,发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象.终效价为对照的85%,而丙酰螺旋霉素Ⅲ、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%.添加Leu对初级代谢影响不大,异戊酸在胞外积累,随后被重新吸收利用,终异戊酰基螺旋霉素Ⅱ和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ组分分别提高了41%和50%.同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%,效价和对照基本一致.
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必特螺旋霉素在大孔树脂HZ820上的吸附动力学研究
在本文中,采用大孔吸附树脂HZ820从水溶液中吸附分离必特螺旋霉素.吸附速率是吸附实验设计中一个很重要的参数.本文以吸附温度,离子强度为考察参数,利用间歇吸附实验,获得必特螺旋霉素在HZ820上的吸附动力学数据和热力学数据.使用准一级方程(pseudo-first-order)、准二级方程(pseudo-second-order)、Freundlich动力学方程、空隙扩散模型(pore diffusion model)和Elovich方程5种模型对实验动力学数据进行拟合,并分析对比了拟合结果.结果表明,准二级方程对实验数据的拟合具有高的相关度,并根据对比结果判断该吸附系统为非均相吸附过程,吸附速率由液膜扩散速率和孔内扩散速率综合控制.Langmuir和Freundlich吸附等温线方程均较好地描述了必特螺旋霉素在HZ820树脂上的吸附相平衡关系.该吸附过程为优惠吸附过程,提高温度和增大离子强度均有利吸附的进行.
