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N-乙酰半胱氨酸对毒胡萝卜素诱导的HepG2细胞内质网氧化应激凋亡的影响
目的 了解N-乙酰半胱氨酸(NAC)对内质网氧化应激介导的肝细胞凋亡的阻抑作用.探讨其治疗肝细胞损伤的作用机制.方法 用毒胡萝卜素(TC)诱导HepG2细胞,建立内质网应激凋亡模型,用NAC进行干预.噻唑蓝(MTT)、流式细胞仪、DNA梯形电泳检测凋亡率及活性氧(ROS),Western印迹检测葡萄糖调节蛋白(GRP)78、Caspase-12酶原及ADP聚合酶(PARP)表达.多样本间均数采用方差分析.结果 用2μmol/L TG诱导HepG2细胞0、24、36和48 h,随诱导时间延长,细胞活力逐渐下降;GRP 78、Caspase-12酶原及PARP表达增高;凋亡率逐渐增加.分别是0.7%±0.5%、27.6%±6.3%、29.7%±3.03%和47.9%±3.5%(P<0.05);ROS产生逐渐增加,分别是14.0%±0.5%、36.1%±300%、38.2%±6.0%和48.3%±12.4%(P<0.05);诱导36、48 h后细胞出现典型DNA梯形条带.10 mmol/L、20 mmol/L NAC分别与2/μmol/L TG共同温育HepG2细胞后发现,NAC可明显提高细胞活力;抑制GRP 78、Caspase-12酶原及PARP表达,细胞凋亡率分别降至14.0%±1.3%和11.0%±0.3%;细胞内ROS的产生减至34.7%±0.8%与31.5%±2.9%.结论 TG作为一种内质网特异的钙离子ATP酶抑制剂,能触发HepG2细胞内质网氧化应激凋亡;而NAC作为巯基合成的前体.直接抑制氧自由基反应,阻断内质网氧化应激介导的细胞凋亡,减轻肝细胞损伤,达到临床治疗肝功能衰竭的作用.
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重组Reg3α蛋白促进胰岛β细胞增殖活性及其机制的研究
构建了鼠源Reg3α蛋白基因工程表达菌E.coli(T7 Expression),经IPTG诱导以包涵体形式表达.通过菌体裂解、洗涤和镍柱亲和层析等纯化步骤,SDS-PAGE和HPLC鉴定制得的重组Reg3α蛋白纯度为97.6％.细胞MTT和BrdU标记检测显示重组Reg3α蛋白能有效促进MIN6细胞和原代胰岛的增殖,Western blot方法证明其能够显著提高Erk1/2和Akt信号分子的磷酸化水平从而刺激细胞增殖.在重组Reg3α蛋白抵抗链脲霉素(Streptozotocin,Stz)诱导MIN6细胞凋亡实验中,未能检出剪切型Caspase-3水平的降低,但MTT结果显示其能维持活细胞数量.在毒胡萝卜内酯(Thapsigargin,Tg)诱导MIN6细胞内质网应激反应(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)实验中,重组Reg3α蛋白能有效降低剪切型Caspase-3水平,同时增强关键分子伴侣GRP78的表达从而抑制细胞凋亡.重组Reg3α蛋白具有作为外源性药物促进胰岛β细胞增殖、抗凋亡的活性,具备根治糖尿病药物研究的潜力.
