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空泡形成细胞毒素A文献资料
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幽门螺杆菌空泡形成细胞毒素A亚单位的克隆表达和P37抗体的制备
空泡形成细胞毒素A(VacA)是幽门螺杆菌(H.pylori)的重要致病因子,研究VacA的致病机制有助于进一步明确H.pylori的致病机制.目的:原核表达H.pylori VacA亚单位P37和P58,制备P37多克隆抗体并分析其活性.方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增H.pylori vacA基因的p37和p58片段,克隆入原核表达载体pQE31,构建重组质粒pQE31-p37和pQE31-p58,转化大肠杆菌(E.coli)M15,诱导蛋白表达.以镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化融合蛋白,以纯化P37蛋白免疫家兔,获取抗P37血清,以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体效价.以蛋白质印迹法(Western blot)分析P37抗体与VacA的结合能力,观察P37抗体对VacA致胃癌细胞空泡化的抑制作用.结果:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,E.coli M15经诱导后表达相对分子质量分别为37kDa(1 Da=0.9921 u)和58 kDa的P37和P58融合蛋白,经纯化后为单一蛋白.纯化P37蛋白免疫家免后获得的抗P37血清抗体效价为1×106.P37抗体能中和VacA阳性H.pylori分泌的VacA,抑制VacA对胃癌细胞的空泡化作用.结论:本实验成功构建了原核表达载体pQE31-p37和pQE31-p58,获得了高纯度单一蛋白和高效价P37抗体,该抗体具有中和VacA毒性的作用.
