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构建psiCHECK-2-解耦联蛋白2双荧光素酶报告基因及其荧光素酶活性的分析
目的:构建含解耦联蛋白2(UCP2)-3’非翻译区(UTR)序列的野生型和突变型质粒的双荧光素酶报告基因载体,探讨微小RNA(miR)-15b对UCP2基因表达的调控作用.方法:应用生物信息软件预测miR-15b的靶基因,分别将预测靶基因UCP2的3'UTR及其突变体克隆到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中,构建UCP2野生型和突变型质粒.并采用测序方法鉴定psiCHECK-2-UCP2载体是否构建成功.将UCP2野生型和突变型质粒分别与miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照在293T细胞中共转染.通过双荧光素酶报告基因检测分析miR-15b对UCP2基因表达的调控作用.结果:测序鉴定证实psiCHECK-2-UCP2双荧光素酶报告基因载体构建成功.双荧光素酶报告基因检测显示转染UCP2野生型和UCP2突变型报告基因的293T细胞过表达miR-15b后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显下降,下调31％(P=-0.003),过表达miR-15b抑制剂后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显增加,上调46％(P=0.01).而miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照对UCP2突变型的表达均无明显影响(P＞0.05).结论:UCP2是miR-15b直接作用的靶基因,且miR-15b结合于UCP2基因3'UTR区域,转录后水平对UCP2有直接的抑制作用.
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MicroRNA-15b 下调Bcl-2促进耐药肺癌细胞凋亡
目的 探讨微小RNA-15b (microRNA-15b,miR-15b)对人肺癌耐药细胞A549/DDP凋亡的影响.方法 采用体外转染法将MicroRNA-15b瞬时转染到A549/DDP细胞后,应用Real-time PCR检测A549/DDP细胞中MicroRNA-15b的表达情况;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡变化;并用Western印迹法(Western blot)检测细胞中Bcl-2表达.结果 转染后miR-15b组的miR-15b表达水平显著增加(P<0.05);miR-15b组细胞凋亡率为:32.4%±5.1%,与Mock组(5.73%±1.2%)和miR-15b-Cont(6.24%±2.4%)比较,差异具有统计学意义(P<0.05);miR-15b组的Bcl-2表达量较对照组明显增加.结论 miR-15b可能通过下调Bcl-2的表达从而诱导A549/DDP细胞的凋亡,这可能为肺癌耐药的治疗提供新靶点.
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微小RNA-15b在结直肠癌中的表达及其细胞生物学功能
目的 观察微小RNA(miR)-15b在结直肠癌中的表达及其对直肠癌SW480细胞株生物学功能的影响.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测40例结直肠癌组织及40例相应正常结直肠组织中miR-15b的表达,同时采用瞬时转染技术对SW480细胞株中miR-15b表达进行下调,通过Transwell、噻唑蓝(MTT)及锥虫蓝染色分别检测细胞的迁移、增殖及存活.结果 miR-15b在结直肠癌组织中的表达水平为8.397±1.245,明显高于正常组织的3.201±1.122,差异有统计学意义(P＜0.01).miR-15b在结直肠癌组织中的表达与TMN分期和淋巴结转移有关(P＜0.05).miR-15b表达下调后,细胞的增殖、迁移及生存能力能力明显下降.结论 miR-15b表达与结直肠癌的发生及发展相关,高miR-15b有助于直肠癌细胞的迁移、增殖及存活.
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微小RNA-15b对结直肠癌细胞增殖的影响及其作用机制
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-15b对结直肠癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测结直肠癌细胞株和正常结直肠细胞中mRNA的表达水平;构建pMIR-Report-转移抑制因子(MTSS1)及pMIR-Report-MTSS1 mut重组质粒,利用双荧光素酶报告系统验证miR-15b与MTSS1之间的靶向关系;在结直肠癌细胞HCT116中转染miR-15b抑制剂和miR-15b mimics,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖,流式细胞术检测周期,PT-PCR和Western blot分别检测MTSS1 mRNA及其蛋白的表达.结果 miR-15b在结直肠细胞中表达上调,MTSS1mRNA表达下调;miR-15b能靶向抑制MTSSI的表达;miR-15b可促进HCT116细胞增殖,抑制miR-15b能抑制HCT116细胞增殖.转染miR-15b抑制剂后,MTSS1 mRNA的表达水平(2.532±0.190)明显升高,转染miR-15b mimics后MTSS1 mRNA表达水平(0.447 ±0.065)明显降低,与阴性对照组(1.107 ±0.084)比较差异均有统计学意义(P=0.004、0.001),同时抑制miR-15b能够上调MTSS1水平.结论 miR-15b通过靶向下调MTSS1促进结直肠癌细胞增殖,抑制miR-15b可上调MTSS1的表达,从而抑制癌细胞的增殖.
