首页 > 文献资料
-
Peroxiredoxin Ⅰ和Ⅱ在小鼠输卵管和子宫的分布与表达
目的:观察Peroxiredoxin Ⅰ和Ⅱ(Prx Ⅰ和Ⅱ)在小鼠输卵管和子宫的分布及其周期性变化.方法:免疫组织化学和蛋白免疫印迹技术.结果:在输卵管中,Prx Ⅰ和Ⅱ免疫阳性反应见于输卵管上皮;而子宫内,Prx Ⅰ免疫阳性反应分布于内膜上皮、腺体上皮和内膜基质,而Prx Ⅱ主要见于内膜基质.蛋白免疫印迹技术也显示这两型蛋白在输卵管和子宫均表达,动情期和动情间期这两型蛋白在输卵管和子宫中的表达水平无显著性差异.结论:提示Prx Ⅰ与Ⅱ在输卵管和子宫中表达稳定,可能为受精和早期胚胎发育提供抗氧化的良好微环境.
关键词： Peroxiredoxin Ⅰ PeroxiredoxinⅡ 输卵管 子宫 小鼠 -
腺花素通过peroxiredoxin Ⅰ对端粒酶表达和细胞死亡的影响
目的 探讨腺花素对白血病细胞端粒酶的影响和作用机制.方法 用不同浓度腺花素(0、2、4、6 μmol/L)处理NB4-LR1细胞不同时间(0、6、12、24 h),Western blotting检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)蛋白的表达,Real-time PCR检测hTERT mRNA水平.用RNA干扰方法在NB4-LR1细胞内降低peroxiredoxin Ⅰ(Prdx Ⅰ)的水平,Western blotting检测hTERT蛋白的表达水平.在NB4-LR1细胞内过表达hTERT,锥虫蓝拒染法检测不同浓度(2、4 μmol/L)的腺花素处理NB4-LR1-hTERT-GFP、NB4-LR1-GFP细胞后,细胞的增殖和活力的改变.结果 Western blotting检测结果显示,腺花素能够呈时间-剂量依赖性抑制hTERT的表达.敲除Prdx Ⅰ后hTERT的表达下降.在NB4-LR1细胞过表达hTERT可以部分抑制腺花素对细胞的毒性作用但不能抑制其诱导的细胞分化.结论 腺花素通过Prdx Ⅰ抑制端粒酶表达,促进细胞的死亡.
关键词： 端粒酶 Peroxiredoxin Ⅰ 腺花素 白血病 细胞死亡 -
人源抗Peroxiredoxin Ⅰ肺腺癌噬菌体抗体的制备及鉴定
目的 构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗Peroxiredoxin Ⅰ(Prx Ⅰ)肺腺癌人源单链抗体.方法 提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(V_H)和轻链可变区基因(V_L),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PeR)将V_H和V_L连接得剑单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiⅠ和NotⅠ双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxⅠ为靶抗原对抗体库进行筛选富集.将阳性克隆用IPTG诱导表达.用SDS-PAGE及Western blotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性.结果 成功构建噬菌体单链抗体库.ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带.在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集.收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测剑其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%.SDS-PAGE及Western blotting证实抗体得到可溶表达.ELISA及免疫细胞化学检测表明抗体能相对特异地与肺腺癌细胞结合.结论 成功构建肺腺癌人源噬菌体抗体库,并从中筛选得到能相对特异地与高表达Prx Ⅰ的肺腺癌细胞D549结合的单链抗体.
关键词： 噬菌体抗体库 单链抗体 Peroxiredoxin Ⅰ 肺腺癌 -
沉默Peroxiredoxin Ⅰ基因增强乳腺癌细胞放射敏感性及其作用机制的实验研究
目的 采用RNA干扰技术沉默过氧化物酶Ⅰ(peroxiredoxin Ⅰ,PrxⅠ)基因,观察乳腺癌MCF-7细胞对X线敏感性变化,探讨其作用机制.方法 将Prx ⅠshRNA真核表达载体pGPU6-Prx Ⅰ和阴性对照质粒pGPU6-HK转染入乳腺癌MCF-7细胞中,经G418稳定筛选后RT-PCR和Western blot检测PrxⅠ表达变化.6 MV X线照射6 Gy后48 h,流式细胞术检测细胞的活性氧水平、细胞周期和细胞凋亡；MTT法测定细胞增殖能力；克隆形成实验观察克隆形成率,计算Do、N、Dq、SF2及放射增敏比(sensitive enhancement ratio,SER)等放射生物学参数,Western blot法检测Rad51及γ-H2 AX蛋白变化.结果 获得2个稳定转染细胞株:pGPU6-HK和pGPU6-Prx Ⅰ.RT-PCR和Western bolt检测显示pGPU6-Prx Ⅰ组中Prx Ⅰ mRNA和蛋白表达均明显抑制.6 Gy的X线照射48 h后,pGPU6-Prx Ⅰ及联合照射(ionizing radiation,IR)组细胞中的活性氧水平、G1期细胞和细胞凋亡明显增加,而细胞增殖能力和S期细胞明显降低,Western blot分析表明Rad51蛋白表达降低,而γ-H2 AX蛋白表达升高(P＜0.05),以pGPU6-Prx Ⅰ+IR组变化显著,其Rad51蛋白表达下降了79.3%,而γ-H2AX蛋白表达升高了3.7倍.pGPU6-PrxⅠ组细胞的Do、N、Dq和SF2值分别为1.354、3.106、1.547和0.504,均低于pGPU6-HK组,SF2时的SER为1.353.结论 下调PrxⅠ基因表达可提高乳腺癌MCF-7细胞的放射敏感性,其作用机制与细胞内活性氧清除能力减弱、DNA双链断裂增加及DNA损伤后修复能力降低有关.PrxⅠ可能是1个理想的肿瘤放射增敏分子靶点.
关键词： Peroxiredoxin Ⅰ 放射敏感性 活性氧 基因沉默 -
腺病毒介导的RNAi技术抑制Peroxiredoxin Ⅰ的表达
目的:为深入研究Peroxiredoxin Ⅰ(Prx-Ⅰ)基因与肿瘤细胞放射敏感性的关系,构建基于腺病毒的抑制Prx-Ⅰ基因表达的RNAi载体.方法:从质粒载体pAVU6-Prx切下包含U6启动子在内的表达盒,连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack,然后在大肠杆菌中重组为完整腺病毒DNA,并将其转染293包装细胞制备腺病毒颗粒,再利用腺病毒感染目的肿瘤细胞,干扰其Prx-Ⅰ基因的表达.结果:成功地将U6表达盒连接到穿梭载体,获得重组的腺病毒DNA,并制备出高滴度病毒.将病毒感染肿瘤细胞SW480以后可以明显抑制Prx-Ⅰ基因的表达,并使细胞受辐射后的细胞凋亡比例增大.结论:基于腺病毒的RNAi干扰是有效的,这为进一步在体内探讨肿瘤放疗增敏机制奠定了基础.
关键词： Peroxiredoxin Ⅰ 电离辐射 重组腺病毒 RNAi
