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As2O3对结膜囊成纤维细胞中Bcl-2表达及其对Fb凋亡的影响
目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对结膜囊成纤维细胞中Bcl-2表达及其对成纤维细胞(fibroblast,Fb)凋亡的影响.方法 取健康哈白兔,麻醉后无菌条件下取兔眼结膜下Tenon's囊组织进行Fb的培养,实验组用5、10 μmol/L的As2O3分别处理24、48 h,对照组加同体积的生理盐水,免疫荧光显微镜下观察Fb细胞核的凋亡,记录不同浓度及作用时间下的凋亡指数,并采用Western blot蛋白印迹法检测Bcl-2的表达.结果 对照组的Fb细胞核呈现浅蓝色,染色质疏松且均匀;实验组的Fb细胞核出现凋亡小体且呈现亮蓝色,细胞核萎缩、凝聚,部分出现断裂.随着As2O3剂量的加大及作用时间的延长,凋亡小体的细胞数增多明显,差异有统计学意义(P＜0.05),且凋亡细胞数出现剂量及时间依赖关系(r=10.235,r=8.330,P＜0.05).As2O3处理后的Fb细胞,其Bcl-2的蛋白表达降低明显,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 As2O3可诱导结膜囊成纤维细胞发生凋亡,且其诱导凋亡作用存在一定的剂量和时间依赖性;凋亡与下调Bcl-2的表达,激活Caspase-3有关.
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大鼠结膜囊成纤维细胞TGFβ2特异性siRNA的筛选及其载体构建的研究
目的 筛选结膜囊成纤维细胞转化生长因子β2(TGFβ2)特异性siRNAs,并构建其载体.方法 采用体外转录法合成4个TGFβ2 siRNAs(L1、L2、L3、L4),分别转染体外培养的大鼠Tenon's囊成纤维细胞,以未转染细胞作为对照,转染后48 h采用RT-PCR技术检测所合成的siRNAs对TGFβ2 mRNA表达的干扰作用;在此基础上,再构建有干扰作用siRNA的载体.结果 与对照组相比,转染48 h后,仅L4能够使大鼠Tenon's囊成纤维细胞TGFβ2的mRNA表达水平明显下调,其余3条TGFβ2 siRNAs未产生明显的干扰效果.经过测序检测证明成功构建了有干扰效果TGFβ2 siRNA的载体.结论 不同的TGFβ2 siRNA对大鼠Tenon's囊成纤维细胞TGFβ2 mRNA表达具有不同的干扰效能;能够构建出有干扰效能的TGFβ2 siRNA特异性载体.
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TGF-β2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究
目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2 mRNA表达的影响.方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照.转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2 mRNA表达的影响.结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势.结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达.
