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布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF的原核表达及布鲁菌免疫逃逸分析
目的 克隆并表达布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF并推测其免疫逃逸机制.方法 以羊种布鲁菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁菌分泌蛋白BspA(BAB1-0678)、BspF(BAB1-1948)基因,连接质粒pMD19-T后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a(+)载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析鉴定表达产物;并与先天性免疫分子的蛋白序列进行比对分析.结果 成功克隆了BspA、BspF基因,片段大小分别为576、1 287 bp;SDS-PAGE显示,BspA、BspF蛋白相对分子质量分别约为28 × 103、55×103;Western blot分析显示,BspA、BspF蛋白均可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应,并且与先天性免疫分子白细胞介素1R(IL-1R)、髓样细胞分化因子88 (MyD88)、Toll样受体2(TLR-2)、Toll样受体4(TLR-4)、单免疫球蛋白白介素1相关受体(SIGIRR)有同源性.结论 成功获得了布鲁菌BspA、BspF蛋白,通过同源性分析,证明BspA、BspF蛋白在布鲁菌感染宿主过程中具有免疫逃逸的作用.研究结果为进一步研究布鲁菌的致病机制和揭示布鲁菌免疫逃逸机制提供了理论依据.
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呼和浩特地区分离人源布鲁菌的分子流行病学特征分析
目的 了解呼和浩特地区分离人源布鲁菌的分子流行病学特征,为指导布鲁菌感染防治提供实验依据.方法 对2013-2015年内蒙古医科大学附属医院分离的27株人源布鲁菌进行常规细菌学和分子鉴定;采用多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)-16方法,对其中9株菌进行分子分型及聚类分析;采用PCR方法对16个毒力基因在27株菌株中的分布情况进行检测和分析.结果 27株菌常规细菌学方法和PCR方法均鉴定为羊种布鲁菌,其中有6株为羊种1型,21株为羊种3型.MLVA-16分型结果显示,9株菌在部分VNTR位点上存在重复数目差异.聚类分析显示,9株菌呈现7个基因型,提示为零星散发病例;同时有2株菌共享同一基因型,提示存在流行病学关联,可能来自同一感染来源.16个毒力基因在27株菌株中均能检测到.结论 呼和浩特地区分离人源布鲁菌主要为羊种1型和3型,毒力基因分布特征相近;部分克隆株存在流行趋势,流行机制值得进一步探究.
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调节性T淋巴细胞对急性期布鲁菌病患者治疗效果的影响
目的 调查布鲁杆菌感染后宿主的体液和细胞免疫应答情况,Foxp3+在布鲁菌病患者治疗过程中的变化,阐明宿主产生免疫抑制对布鲁菌病治疗效果的影响.方法 2015年7月至2015年11月,黑龙江农垦总局总医院感染三科住院的急性期布鲁菌病患者 65例.标准治疗组28例,根据患者情况选择抗菌药物进行3个疗程的标准治疗,每个疗程20 d,疗程间隔10 d;免疫增强剂组37例,在标准治疗的基础上增加免疫增强药物.另选取健康体检者30名为健康对照组.在治疗前和每个疗程结束时,采用流式细胞术检测患者外周血中CD3+CD4+Foxp3+Treg含量变化.符合正态分布的数据以x-±s表示,两组间比较采用t检验,多组间的比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK法.不符合正态分布的数据进行多个独立样本的非参数检验.结果 65例急性期布鲁菌病患者第1疗程结束时外周血中Foxp3+Treg含量为2.83%,第2疗程结束时为3.77%,第3疗程结束时为4.03%,均高于健康对照组的1.69%(t值分别为 5.97、9.05和5.66,均P<0.01).第1疗程结结束时,标准治疗组和免疫增强剂组间外周血Foxp3+Treg含量差异无统计学意义(t=0.33,P>0.05),但均高于健康对照组(t值分别为7.09和 4.94,均P<0.01).第2疗程结束时,免疫增强剂组患者外周血Foxp3+Treg含量高于标准治疗组,差异有统计学意义(t=2.22,P<0.01),且两组均高于健康对照组(t值分别为10.79和7.25,均P<0.01).第3疗程结束时,免疫增强剂组患者外周血Foxp3+Treg含量高于标准治疗组和健康对照组,差异均有统计学意义(t值分别为6.02和6.45 ,P<0.01).结论 急性期布鲁菌病患者经过添加免疫增强剂的治疗,外周血Foxp3+Treg含量呈现持续上升的趋势,并一直维持在一定高位水平.推测,过早的使用免疫增强剂可能不利于急性期布鲁菌病的治疗.
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布鲁氏菌外膜蛋白Omp16的原核表达、纯化及多克隆抗体制备
目的 克隆、表达、纯化布鲁氏菌Omp16重组蛋白,并制备多克隆抗体,评估其作为布鲁氏菌蛋白质疫苗的可行性.方法 PCR法扩增全长及截短的布鲁氏菌Omp16基因,并将其克隆入pET28a(+)载体中;经菌液PCR和测序鉴定后,再转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达及镍柱纯化后,获取高纯度的Omp16目的蛋白,然后将其免疫BALB/c小鼠以制备多克隆抗体,Western blotting检测抗体的特异性免疫反应.结果 成功构建了全长及截短表达的Omp16原核表达质粒,经IPTG诱导表达后,获得了全长及截短Omp16蛋白,免疫BALB/c小鼠后获得了高效价的抗Omp16多克隆抗体.Western blotting实验证实2种Omp16重组蛋白(Omp16-1、Omp16-2)均能与其相应抗体发生特异性免疫反应.结论 该研究成功克隆、表达、纯化了全长及截短的Omp16重组蛋白,2种Omp16重组蛋白均具有很好的免疫原性,且能与高滴度的小鼠多克隆抗体发生特异性结合,为后续以Omp16蛋白为基础的疫苗研发奠定了实验基础.
