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抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5的药理学分析
目的 分析抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对动物的药理作用,为其安全性用药提供实验依据.方法 取昆明(KM)小鼠,经尾静脉分别注射1、3和9 mg/kg TAP-SSL5,观察其对小鼠神经系统的影响;取SD大鼠,经尾静脉分别注射1和3 mg/ kg TAP-SSL5,设溶剂[20 mmol/L甘氨酸(Gly)-NaOH缓冲液,pH 10.6]为对照组,观察其对呼吸系统和心血管系统的影响.结果 TAP-SSL5对KM小鼠一般行为状态、协调机能和戊巴比妥钠阈下剂量催眠的协同作用无明显影响;对SD大鼠的血压、呼吸频率和心率无明显影响,与溶剂对照组比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5对动物的神经系统、呼吸系统和心血管系统无明显影响,表明其具有较好的安全性,且无明显的毒副作用.
关键词： 金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 蜱抗凝血肽 融合蛋白 药理学 -
融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒与THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响
目的 探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板微粒(platelet microparticles,PMPs)与人单核细胞株THP-1细胞结合及Mac-1活化的影响.方法 以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)激活人血小板并获取PMPs.采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)及PE标记的抗CD62P单克隆抗体、FITC标记的Annexin V检测PMPs,以FITC标记的抗CD41单克隆抗体和PE标记的抗CD154(CD40L)单克隆抗体检测PMPs的表面特征.采用JC-1试剂盒检测血小板线粒体膜电位.采用FCM检测PMPs与THP-1细胞的结合,以及PMPs诱导THP-1细胞表面Mac-1(CD11 b/CD18,αMβ2)的活化情况,并研究TAP-SSL5的干预作用.结果 PMPs呈现CD62P和Annexin V双阳性,且CD41和CD40L的阳性率分别达到50.8％和44.0％.JC-1检测显示,ADP对血小板线粒体膜电位无明显影响(P＞0.05).PMPs与THP-1细胞的结合率为(24.80 ±5.16)％,PMPs诱导THP-1细胞Mac-1的活化率为(21.17±5.92)％,THP-1细胞经10 mg/L TAP-SSL5预处理后,PMPs的结合率下降至(13.67±2.15)％(P＜0.05),Mac-1的活化率下降至(0.99±0.62)％(P＜0.01).结论 TAP-SSL5可抑制PMPs与THP-1细胞的结合及THP-1细胞表面Mac-1的活化.
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融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合的影响
目的 探讨融合蛋白TAP-SSL5对血小板与粒细胞结合作用的影响.方法 采用CCK-8试剂盒检测TAP-SSL5对细胞活力的影响；流式细胞仪检测THP-1细胞表面CD162(PSGL-1)的表达,及TAP-SSL5对小鼠抗人CD162单抗KPL-1与THP-1细胞结合的抑制作用.以20 μmol/L ADP激活人血小板,采用流式细胞仪、瑞氏-姬姆萨染色检测血小板与THP-1细胞或人中性粒细胞的结合情况,并研究TAP-SSL5的干预作用.结果 TAP-SSL5浓度在30 mg/L或以下时对THP-1细胞或中性粒细胞的活力无明显影响.流式细胞仪检测显示,TAP-SSL5(终浓度10 mg/L)能显著抑制KPL-1与THP-1细胞的结合；20μmol/L ADP激活的血小板与THP-1细胞或中性粒细胞的结合率分别为(31.3±8.4)％和(35.6±5.9)％；细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,其结合率分别降至(13.4±6.7)％和(10.4±6.4)％(P＜0.01).瑞氏-姬姆萨染色的结果表明,TAP-SSL5和SSL5均可抑制激活的血小板与中性粒细胞的结合(P＜0.05).结论 TAP-SSL5可通过与PSGL-1的结合,而直接抑制激活的血小板与粒细胞的结合.
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融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响
目的 探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响.方法 采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板.流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b( glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体( HIP1)与血小板的结合情况；以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度；以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响；为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响.结果 融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用.但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30m g/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4％)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3％)；终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集.给小鼠单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P ＜0.01)；而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板.
关键词： 金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 蜱抗凝血肽 融合蛋白 血小板 糖蛋白GPIbα -
125I标记融合蛋白TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学研究
目的 研究125I标记的抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5单次静脉注射后在健康日本大耳兔体内的药代动力学过程.方法 采用固相氧化法(Iodogen法)将Na125I直接标记于TAP-SSL5,由耳缘静脉给每只大耳兔注射18.5×103 kBq的125I-TAP-SSL5,分别于注射后1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min采血,称量并测定放射性计数(Counts per minute,cpm),换算为血液放射性浓度,经DAS软件分析得出佳房室模型及相关药代动力学参数.结果 纸层析法测得125I-TAP-SSL5的标记率为(67.32±9.91)％,放射化学纯度为(91.62±3.22)％,比活度为(30.2±4.4) TBq/μmol；TAPSSL5在大耳兔体内的药代动力学过程符合权重为1的二室模型,分布相半衰期(t1/2α)及消除相半衰期(t1/2β)分别为(0.08±0.04)h和(4.97 ±0.75)h,清除率(Clearance,CL)为(0.015 ±0.011) ml/h,一室向二室转运常数(K12)为(6.651±3.642)/h,二室向一室转运常数(K21)为(4.072 ±1.737)/h.结论 125I-TAP-SSL5在健康大耳兔体内的药代动力学过程符合权重系数为1的二室模型,自体清除率缓慢,可保证与组织有更多的结合几率.
关键词： 金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5 蜱抗凝血肽 融合蛋白 药代动力学 放射性核素标记 -
抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5表达载体的构建及其功能研究
目的 构建一种具有抗炎和抗凝双效功能的融合蛋白,并对共功能进行初步鉴定.方法 将重组金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(staphylococcal supemntigen-like protein-5,SSL5)与蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)融合,从金黄色葡萄球NCTC8325菌株中克隆SSL5基因;经DNA重组技术,将编码pelB前导序列、SSL5和TAP的基因重组并克隆于原核表达载体pHOG21中,再转染于大肠杆菌B121中扩增表达,制备融合蛋白SSL5-TAP或TAP-SSL5,采用流式细胞仪检测融合蛋白是否和SSL5一样,具有与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白对活化的凝血因子X(factor Xa,FXa)活性的抑制作用.结果 TAP-SSL5保留了SSL5与PSGL-1结合的特性,并且融合蛋白TAP-SSL5可显著抑制FXa的活性(P<0.01),抑制率达39.5%.结论 融合蛋白TAP-SSL5是一种以PSGL-1为靶向的新型抗炎、抗凝双效分子.
