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LTB-MOMP融合基因表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
目的 构建含大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LTB)和鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白(MOMP)融合基因(LTB-MOMP)的表达载体,并在原核细胞中表达融合蛋白.方法 应用PCR从质粒EWD299和鹦鹉热衣原体中扩增LTB和MOMP基因,经与柔性肽连接后,插入pET-28a载体中,酶切鉴定正确后,转化大肠杆菌Rosetta,IPTG诱导表达,并纯化目的 蛋白.SDS-PAGE和Western blot分析外源蛋白的表达及表达产物的抗原特异性.结果 重组工程菌可以表达相对分子质量约为54 000的LTB-MOMP融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的42%,LTB-MOMP融合蛋白具有良好的抗原特异性.结论 已成功构建了LTB-MOMP融合基因表达载体,并在原核细胞中获得表达.
关键词： 鹦鹉热衣原体 大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 主要外膜蛋白 原核表达 -
LT-B转基因烟草植株的建立
目的构建大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位(LT-B)基因的植物表达载体,并建立LT-B转基因烟草植株.方法用PCR从pMMB68扩增LT-B编码基因,将其克隆于pUCmT和pBI121载体,进而构建植物表达双元载体pBI-LTB,LT-B基因由CaMV 35S启动子控制表达;将pBI-LTB用电穿孔法导入根瘤农杆菌LBA4404;采用叶盘共培育法经根瘤农杆菌介导转化烟草,获得转基因烟草植株;用PCR、Southern、Western blot和ELISA检测转基因植株.结果经PCR及Southern杂交分析,共发现12株烟草的基因组中有LT-B基因整合;Western blot和ELISA分析表明有9株转基因烟草能有效表达LT-B蛋白,其表达量为烟草叶片总可溶蛋白的3.36～10.56μg·g-1TSP.结论建立的LT-B转基因烟草植株可成功表达LT-B,并具有五聚体结构,为进一步生产预防婴幼儿大肠杆菌腹泻可食用疫苗及黏膜免疫佐剂奠定了基础.
关键词： 大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 转基因烟草 植物疫苗 根瘤农杆菌
