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天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白的原核表达、纯化与发酵
目的 原核表达天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,并进行纯化和发酵.方法 全基因合成带有凝血酶切割位点的天蚕素B和表皮生长因子融合基因.克隆人pET22b(+)-X表达载体中.构建重组质粒pET22b-Cecropin B-EGF,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta-gami2(DE3),经IPTG诱导后.进行SDS-PAGE及Western blot分析.镍离子亲和层析纯化融合蛋白并复性后,对其促表皮生长活性进行测定,后在5 L发酵罐中进行发酵.结果 酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入pET22b(+)-X表达载体中;SDS-PAGE分析显示,天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白在Rosetta-gami2(DE3)宿主菌中得到了有效表达,表达量约占全菌总蛋白的30%;Western blot分析显示,表达产物可与表皮生长因子单克隆抗体特异结合;融合蛋白的表达形式为包涵体;纯化、复性后的融合蛋白具有促BALB/c 3T3细胞生长的活性,在5 L发酵罐中进行发酵,1次可收获菌体约60 g.结论 已成功地在大肠杆菌Rosetta-gami2(DE3)中表达了天蚕素B和表皮生长因子融合蛋白,为研究具有抗菌和促伤口愈合的双功能药物奠定了基础.
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抗菌肽天蚕素B对铜绿假单胞菌感染小鼠创面的抗菌作用
目的 观察抗菌肽天蚕素B对小鼠铜绿假单胞菌感染创面的抗菌效果.方法 于30只ICR小鼠背部切除全层皮肤(创面为1 cm×1 cm),将铜绿假单胞菌菌液涂抹于创面制成感染模型,并随机分为对照组、磺胺米隆组、抗菌肽组,伤后3 h分别用含等渗盐水、100 g/L磺胺米隆溶液、1 g/L天蚕素B的纱布湿敷,每组10只.伤后1～4 d对各组小鼠创面行大体观察;伤前和伤后4 d测量体温,抽取血液观察白细胞变化;伤后4 d检测痂下肌肉组织细菌定量和观察存活情况.结果 对照组创面分泌物多、创面潮湿;磺胺米隆组、抗菌肽组创面结痂、干燥、无明显分泌物.各组小鼠术后体温多数上升、白细胞计数均减少.抗菌肽组痂下肌肉组织细菌定量为(42±50)集落形成单位(CFU)/g,明显少于磺胺米隆组(886±804)CFU/g(P＜0.05),两组均明显低于对照组(41±28)×105CFU/g(P＜0.01).对照组小鼠伤后4 d存活数明显少于抗菌肽组、磺胺米隆组(P＜0.05).结论 天蚕素B对ICR小鼠铜绿假单胞菌感染创面有明显的抗感染作用,可明显降低其死亡率.
