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UT-7/EPO细胞培养条件的优化及复壮
目的 使复苏后处于衰亡状态的UT-7/EPO细胞恢复正常生长状态,并优化其生长密度.方法 通过更换不同培养基(改良的RPMI 1640、DMEM和IMDM培养基)、调整血清浓度(10％、15％和20％)、改变生长因子加量(1、3、5 U/ml)及将小鼠腹腔细胞作为饲养细胞与UT-7/EPO细胞共培养,对UT-7/EPO细胞进行复壮.对恢复正常生长状态后的UT-7/EPO细胞,利用CCK-8法绘制细胞生长曲线,并根据生长曲线通过梯度密度培养确定UT-7/EPO细胞在不同培养器皿(48、24、12、6L板及25 cm2细胞培养瓶)中的适培养密度.将传代后第2天处于对数生长期的UT-7/EPO细胞冻存及复苏传代3次后,连续培养9 d,检测复壮后UT-7/EPO细胞的初步稳定性.将复壮后UT-7/EPO细胞分别用人源STR试剂及小鼠细胞STR位点进行鉴定.结果 更换培养基、改变血清和生长因子加量均不能使衰亡的UT-7/EPO细胞的生长状态有明显改善;饲养细胞与UT-7/EPO细胞共培养可使UT-7/EPO细胞恢复正常生长状态;获得了UT-7/EPO细胞在不同培养器皿中的适培养密度.复苏后的细胞生长状况良好,与未冻存前的生长状态及活力相当.人源STR位点检测结果显示,复壮后的UT-7/EPO细胞STR图谱均为单个或2等位基因峰,无其他人源细胞的污染;小鼠STR位点检测结果显示,复壮后的细胞未发现饲养细胞的污染.结论 饲养细胞能够有效地使UT-7/EPO细胞复壮;适的细胞生长密度能有效地使细胞维持在稳定、良好的生长状态.
关键词： UT-7/EPO细胞 培养条件 优化 复壮 -
重组人促红细胞生成素生物学活性细胞学测定方法的建立
目的 建立重组人促红细胞生成素生物学活性细胞学的测定方法.方法 通过MTT比色法考察rhEPO对UT-7/EPO细胞增殖的促进作用,从而反映rhEPO的生物学活性.结果 rhEPO在0.005～100ng·mL-1浓度范围内对细胞的增殖具有促进作用;优化后的试验参数为:rhEPO起始浓度100ng·mL-1,3倍稀释,10个梯度;细胞上板密度5×105个/mL;细胞与rhEPO共培养48h.利用优化后的试验参数建立rhE-PO活性曲线,结果表明rhEPO浓度与吸光值相关性良好;曲线斜率的RSD为2.6％,DC50的RSD为6.5％,表明该方法有很好的重复性.结论 成功建立并优化rhEPO 生物学活性的细胞学测定方法,该方法有很好的重复性,可应用于rhEPO 的生物学活性检测.
关键词： 重组人促红细胞生成素 生物学活性 UT-7/EPO细胞 -
重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP的构建及其对UT-7/Epo细胞感染效率的检测
目的 构建携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,并且研究该病毒对人白血病细胞UT-7/Epo的感染效率及其在细胞中的复制.方法 先通过分子克隆技术构建重组腺病毒质粒pAd5F11pTPEGFP,然后利用脂质体转染法,将其转染至HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5 F11 pTPEGFP,经酶切和PCR鉴定正确后,扩增并纯化得到滴度较高的重组腺病毒.以空载体病毒Ad5GFP作为对照,将纯化的重组腺病毒感染UT-7/Epo细胞,经流式细胞仪检测在不同感染复数(MOI)下荧光阳性细胞比例,即为Ad5F11pTPEGFP病毒对UT-7/Epo细胞的感染效率,同时将冻融后的重组腺病毒感染的UT-7/Epo细胞上清感染HEK293细胞,48 h后观察GFP在HEK293细胞中的表达.结果 成功制备了重组腺病毒Ad5 F 11 pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞的感染效率明显高于空载体对照病毒Ad5GFP,在MOI为200时,感染效率达98.2％,而空载体病毒在MOI为200时,对UT-7/Epo细胞的感染效率仅为29.7％.感染了重组腺病毒的UT-7/Epo细胞冻融上清感染新的HEK293细胞后,荧光显微镜下观察到GFP的表达.结论 成功构建了重组腺病毒Ad5F11pTPEGFP,其对UT-7/Epo细胞有较高的感染效率,并能在其中复制.
关键词： 重组腺病毒 端粒酶 纤维顶球 UT-7/EPO细胞
