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小鼠脑缺血后氧化DNA损伤的早期修复与神经保护的相关性研究
目的 建立原位检测C57BL/6小鼠脑缺血所致AP位点和3'-PO4型氧化DNA损伤的方法,同时采用TUNEL测定神经细胞凋亡,探讨两者的相关性,并观察nNOS在此过程中的作用.方法 制作小鼠前脑缺血/再灌注模型(FbIR):夹闭双侧颈总动脉90 min后恢复血流,按实验设计的再灌注不同时间点处死动物后制作脑组织冰冻切片.用大肠杆菌核苷酸外切酶Ⅲ敏感位点法(EXOSS)检测AP位点和3'PO4末端型两种氧化DNA损伤;采用TUNEL技术观察细胞凋亡,并检测特异性nNOS抑制剂3BR7NI对此氧化DNA损伤及细胞凋亡的影响.结果 与假手术对照组相比,EXOSS阳性率在再灌注15 min时至少增高20倍(P＜0.01),并在此后的30 min内持续增高;EXOSS阳性主要出现在神经元的细胞核内;细胞死亡在再灌注24 h组能检测到,并主要发生在神经元细胞内;在一定时间内大脑皮质区神经元细胞内的氧化DNA损伤和细胞凋亡均能被特异性nNOS抑制剂3-bromo-7-nitroindazolc(3BR7NI,30 mg/kg,腹腔内注射)所抑制.结论 EXOSS是一种原位检测AP位点和3'-PO4末端型氧化DNA损伤的有效方法,该损伤在一定时间内可以得到修复,nNOS在这一过程中起着重要作用.
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nNOS介导小鼠局灶性脑梗死后氧化DNA损伤的机制研究
目的 探讨还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)阳性神经元表达与脑梗死后DNA损伤修复过程的相关性.方法 制作小鼠前脑缺血-再灌注模型(FbIR), 夹闭双侧颈总动脉90 min后恢复血流, 再灌注15 min后处死动物制作脑组织冰冻切片.A组(n=10):FbIR90/15 min;B组(n=4):FbIR90/15 min+3BR7NI;C组(n=10):假手术对照组;D组(n=4):采用组织化学染色法观察NADPH-d阳性神经以元的分布.A、B两组分别用大肠杆菌核苷酸外切酶Ⅲ敏感位点法(escherichia coli exonuclease Ⅲ sensitive sites,EXOSS) 检测AP位点和3′-PO4末端型两种氧化DNA损伤.用EXOSS检测AP位点和3′-PO4末端型 两种氧化DNA损伤;采用组织化学染色法观察NADPH-d 阳性神经元的分布.结果 EXOSS法可检测到大脑不同部位的氧化DNA损伤,主要集中在大脑皮质区、下丘脑弓形核区、纹状体和海马区;特异性NOS抑制剂3BR7NI明显减弱全脑的EXOSS信号强度(P<0.000 1),差异有显著性, 其作用主要表现在大脑皮质区,而对下丘脑的弓型核等区作用较弱; NADPH-d 阳性神经元主要分布在大脑皮层、纹状体、丘脑和齿状核,下丘脑的弓型核区仅见少量染色,EXOSS / NADPH-d的表达对比显示, 在大脑皮质区EXOSS信号主要在NADPH-d阳性神经元中.结论 脑梗死后大脑不同区域氧化DNA损伤的机制不一, 3BR7NI仅消除大脑皮层区的EXOSS 染色, 而对下丘脑弓形核区的作用不大, 本研究从形态学证实了大脑皮层区nNOS可能参与了脑梗死后氧化DNA损伤修复过程,而下丘脑的弓型核区的这一过程可能有其他机制参与.
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银杏酮酯抗H2O2诱导衰老海马神经元氧化DNA损伤的作用研究
目的:探讨银杏酮酯(Ginkgo biloba extract,GBE50)抗过氧化氢(H2O2)诱导大鼠衰老海马神经元氧化DNA损伤的作用及人类长寿基因(Silent information regulator 1,SIRT1)在其中的作用机制.方法:培养、鉴定大鼠原代海马神经元.将细胞随机分为4组,正常对照组,H2O2模型组,银杏酮酯组和阳性对照银杏叶提取物(EGB761)组.正常对照组用培养基24小时,模型组用H2O2(200μM)诱导18小时建立细胞衰老样模型,后两组分别用200μg/ml的银杏酮酯和银杏叶提取物预处理6小时后再加入H2O2诱导18小时.细胞免疫荧光方法观察各组神经元中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)和SIRT1的表达强度;免疫印迹方法检测SIRIl、p53和p21的蛋白水平.结果:光镜下观察培养6～7天时海马神经元逐渐成熟,免疫荧光鉴定神经元纯度达到90％以上.细胞免疫荧光结果显示:与正常对照组相比,H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元中8-OHDG表达增加(P＜0.01),SIRT1的表达降低(P＜0.01).200μg/ml银杏酮酯和阳性对照银杏叶提取物预处理后8-OHDG表达减少(P＜0.05),SIRT1的表达增加(P＜0.05).免疫印迹结果显示:与正常对照组相比,H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元中SIRT1蛋白表达下降,p21蛋白表达增加(P＜0.05);200μg/ml银杏酮酯和阳性对照银杏叶提取物预处理后H2O2诱导的海马神经元SIRTl蛋白表达增加(P＜0.05),p21蛋白表达下降(P＜0.05);而p53蛋白变化不明显(P＞0.05).结论:200μg/ml的银杏酮酯可降低H2O2诱导的大鼠原代衰老海马神经元内8-OHDG表达,其机制可能与SIRT1、p21蛋白表达有关.
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银杏酮酯抗自然衰老大鼠前额叶皮层氧化DNA损伤和延缓端粒长度的作用及其机制探讨
目的:探讨银杏酮酯(GBE50)抗自然衰老大鼠前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC)氧化DNA损伤和延缓端粒长度的作用及SIRT1在其中的作用机制.方法:建立自然衰老大鼠模型,用GBE50(100mg/kg)每日灌胃,连续60天.免疫荧光双标观察PFC中8-OHDG的亚细胞定位及表达强度;荧光定量PCR(Real time-PCR)检测PFC全基因组DNA相对端粒长度;Western-blot检测SIRTl、p53和p21的蛋白水平.结果:免疫荧光双标结果显示8-OHDG主要位于PFC神经元胞体中.与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC神经元8-OHDG表达增加,GBE50 (100mg/kg)处理后减少.RT-PCR结果显示:与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC相对端粒长度缩短,GBE50(100mg/kg)处理后相对端粒长度缩短延缓.Western blot结果显示:与青年对照组相比,自然衰老大鼠PFC的SIRTl蛋白表达下降,p21蛋白表达增加;GBE50(100mg/kg)处理后自然衰老大鼠PFC的SIRT1蛋白表达增加,p21蛋白表达有下降趋势;而p53蛋白变化不明显.结论:GBE50 (100mg/kg)可降低自然衰老大鼠PFC内8-OHDG表达,延缓相对端粒长度缩短,其过程可能与SIRT1、p21蛋白表达有关.
