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从大容量抗体库中筛选抗蓖麻毒蛋白抗体
目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗蓖麻毒蛋白的人源抗体.方法:将蓖麻毒蛋白固定在抗原管上,通过5轮"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选到特异性抗体,并转染到HB2151菌中,经IPTG诱导,制备抗蓖麻毒蛋白的可溶性单链抗体.结果:经过5轮筛选,获得40个与蓖麻毒蛋白结合的阳性克隆,其中12个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.并将其制备成可溶性的抗体.结论:利用单链大容量抗体库获得抗蓖麻毒蛋白的噬菌体抗体并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定基础.
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人外周血γδ T细胞的可溶性anti-TCRγδ抗体扩增及其培养和保存的条件
目的:比较人外周血γδ T细胞不同的制备方法,摸索适于临床应用的培养和保存条件.方法:分离人外周血单个核细胞,分别以固相化和可溶性anti-TCRγδ抗体进行刺激,以添加小牛血清或人AB血浆的RPMI 1640培养液或AIM V无血清培养液进行培养,采用锥虫蓝染色法检测γδ T细胞存活率,采用免疫荧光染色法考察γδ T细胞的纯度和亚型,采用乳酸脱氢酶(lacate dehydrogenase,LDH)法检测γδ T细胞对不同肿瘤细胞系的杀伤作用.结果:添加15%小牛血清和添加5%人AB血浆的RPMI 1640培养液对γδ T细胞的培养效果接近,均优于AIM V无血清培养液.可溶性抗体与固相化抗体扩增外周血γδ T细胞的效果相似;可溶性抗体扩增的γδ T细胞受体(T cell receptor,TCR)库容完整,同时具有TCR Vδ1和Vδ2两种亚型;对肺癌、肝癌和卵巢癌细胞系均有体外杀伤活性.这些γδ T细胞在含1%人AB血浆或0.25%人血白蛋白的生理盐水中、4 ℃条件下保存12 h,细胞存活率仍达95%以上.结论:可溶性anti-TCR γδ抗体和含有人AB血浆的RPMI 1640培养液可以用于人外周血γδ T细胞的体外扩增,扩增得到的γδ T细胞在含有血浆或白蛋白的生理盐水中稳定性较好.
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人源抗创伤弧菌溶血素蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定
目的 从天然单链(scFv)大容量噬菌体抗体库中筛选特异性抗创伤弧菌溶血素蛋白(vibrio vulnificus haemolysin,VVH)的scFv并进行初步鉴定.方法 以表达纯化后的VVH为靶抗原,采用酸洗脱的方法从天然大容量噬菌体抗体库中筛选人源抗VVH噬菌体单链抗体,并将噬菌体抗体的上清梯度稀释后感染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后获得抗VVH蛋白可溶性单链抗体,ELISA检测其与抗原结合活性,DNA序列测定鉴定抗体序列.结果 经过4轮筛选,共筛选到22株可以与VVH结合的噬菌体阳性克隆,其中8株获得可溶性表达,DNA序列分析表明获得3株可变区基因型不同的单链抗体.结论 利用大容量噬菌体抗体库筛选技术获得抗创伤弧菌溶血素蛋白的可溶性抗体,为创伤弧菌感染的治疗奠定了基础.
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人源抗梭曼过渡态类似物(P6)的抗体筛选
目的:从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗梭曼过渡态类似物的人源单链抗体(scFv)并进行鉴定.方法:以膦酸梭曼水解过渡态类似物五配位.羟基膦酸酯,3-羟基-1-对硝基苯基甲膦酸单频哪基醇酯,为半抗原,通过吸附-洗脱-扩增过程从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性进行鉴定.结果:经过4轮的筛选,分别获得14个抗梭曼类似物的阳性克隆.经DNA指纹分析,判断所获克隆分别包含4个不同的抗梭曼类似物的scFv基因.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗梭曼类似物抗体.
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从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体
目的 从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗生存素(survivin)的人源单链抗体(single chain fragment variable,scFv)并进行鉴定.方法 以survivin为抗原,固化在抗原管上,通过吸附-洗脱-扩增过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性噬菌体抗体,并转染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导制备成可溶性抗体,采用酶联免疫吸附测定法对其抗原结合活性进行检测,指纹图谱分析法分析抗体基因的种类.结果 经过4轮筛选,共获得21个与survivin结合的阳性克隆,其中10个特异性结合的克隆,指纹分析有8种不同的抗survivin的scFv基因,在这8种中有5种获得可溶性表达.结论 利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗生存素抗体,为其在今后肿瘤治疗中的应用奠定基础.
