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大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)诱导小鼠Th1细胞的活化作用
目的:探讨MBP对小鼠T细胞的调节作用.方法:采用淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏淋巴细胞,在体外用MBP刺激淋巴细胞,通过MTT法测定淋巴细胞增殖反应;ELISA检测脾细胞培养上清中细胞因子的分泌水平;MBP免疫小鼠后,ELSPOT检测MBP刺激脾淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数;免疫组化检测MBP与T细胞的结合作用.结果:MBP以剂量依赖关系促进小鼠淋巴细胞的增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ,轻微抑制IL-4的分泌;ELSPOT检测细胞分泌IFN-γ结果显示,MBP可诱导特异性Th1活化,也可刺激非特异性Th1活化;免疫组化结果显示,抗MBP抗体可与经MBP刺激的淋巴细胞发生反应,阳性细胞占总淋巴细胞的37.7%,当MBP采用 1∶2 000抗MBP抗体中和后,再与淋巴细胞反应,结果未见阳性细胞.结论:MBP可作用于淋巴细胞诱导非特异性Th1活化,也可通过免疫诱导大量特异性Th1活化;MBP可作为新的免疫增强剂开发利用.
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人心肌型脂肪酸结合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化
人心脏型脂肪酸结合蛋白(Heart type-fatty acid binding protein,H-FABP)是存在于心肌细胞质内的小分子可溶性蛋白质,占心脏全部可溶性蛋白的4％～8％,具有很强的器官特异性.在急性心肌梗塞(AMI)早期,心肌细胞中H-FABP大量增加,因此可将其作为急性心肌梗塞等心肌损伤的生化标志物.大肠杆菌是常用的可快速生产重组蛋白的宿主,且融合或嵌合“标签”蛋白连接靶蛋白不仅能提高靶蛋白的溶解性,同时也可以防止细胞内的蛋白水解.作者旨在获得重组可溶性人心肌型脂肪酸结合蛋白(H-FABP),为进一步开发应用奠定基础.选择麦芽糖结合蛋白(MBP)作为H-FABP的融合标签蛋白,以提高H-FABP在大肠杆菌中的可溶性表达能力.通过RT-PCR扩增人H-FABP的基因序列,将目的基因克隆入pET28a表达载体,转化到DH5α感受态细菌中扩增得到原核表达重组质粒pET28a-MBP-H-FABP.将质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导,表达MBP-H-FABP融合蛋白,同时SDS-PAGE分析验证.后经镍固定金属亲和层析纯化及离子亲和纯化法纯化,并经SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定纯化后重组蛋白的免疫特异性.SDS-PAGE和免疫印迹分析显示重组蛋白相对分子质量约为55 k.经Ni+2-NTA纯化后,MBP-H-FABP重组蛋白在SDS-PAGE电泳下获得单一条带,且MBP-H-FABP可与商业化的H-FABP单克隆抗体(Clone 12-1)呈特异性反应.其意义在于提供在大肠杆菌中制备可溶性重组人H-FABP的方法,为研究其生物学功能和制备单克隆抗体以及今后进行大规模的生产奠定了基础.
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人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化
为获得重组可溶性人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL),该研究首先通过RT-PCR技术扩增人NGAL的基因序列,将目的基因克隆入pET28a表达载体,转化到DH5a感受态细菌中扩增得到原核表达重组质粒pET28a-MBP-NGAL.将质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导,表达MBP-NGAL融合蛋白,同时SDS-PAGE电泳分析验证.后经镍固定金属亲和层析纯化及离子亲和纯化法纯化,并经SDS-PAGE和免疫印迹分析鉴定纯化后重组蛋白的免疫特异性.SDS-PAGE和免疫印迹分析结果表明重组蛋白相对分子质量约为25k.经Ni2+-NTA纯化后,MBP-NGAL重组蛋白在SDS-PAGE下获得单一条带,且MBP-NGAL可与商业化的NGAL单克隆抗体(Clone NL-2)呈特异性反应.制备的NGAL融合蛋白高度可溶,且融合蛋白产物纯度达到90％以上.因此,该研究提供在大肠杆菌中大量生产可溶性重组人NGAL的方法,为进一步研究其生物学功能和制备单克隆抗体奠定了基础.
关键词： 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 麦芽糖结合蛋白 表达 纯化 大肠杆菌 -
肝癌相关抗原kinectin基因重组蛋白致敏的树突状细胞对T细胞增殖活化的影响
目的 观察肝癌相关抗原kinectin基因重组蛋白(kinectin-MBP)致敏的树突状细胞(DC)对T细胞增殖活化能力的影响.方法 从正常人外周血中分离单个核细胞,用rhGM-CSF、rhIL-4联合诱导扩增DC;用kinectin-MBP(kinectin-MBP组)、麦芽糖结合蛋白(MBP组)分别致敏DC,对照组不处理.采用ELISA法检测细胞上清液中的IL-12、IFN-γ,MTT法检测各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力.结果 kinectin-MBP组上清液中IL-12、IFN-γ含量分别为(615.32±7.93)、(544.28±7.17)pg/ml,MBP组分别为(382.13±5.21)、(308.46±6.44)pg/ml对照组组分别为(299.40±10.22)、(228.03±6.70)pg/ml,三组相比,P均＜0.05.kinectin-MBP组T淋巴细胞增殖指数为53.14±0.62,MBP组为22.14±0.31,对照组为10.86±0.65,三组相比,P均＜0.001.结论 体外诱导扩增的DC经kinectin-MBP致敏后具有很强的刺激自体T细胞增殖的能力.
关键词： 树突状细胞 kinectin基因 重组蛋白 T细胞 麦芽糖结合蛋白 -
MBP在小鼠肝癌H22荷瘤模型中的抗肿瘤作用
目的:探讨大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)在小鼠肝癌H22荷瘤模型中的抗肿瘤作用及可能机制.方法:将12只6～8周龄的BALB/c小鼠皮下注射2×106个H22细胞,建立荷瘤模型,荷瘤后第2天将小鼠分为PBS组和MBP组,每组6只,并通过皮下瘤旁注射给药的方式进行干预,期间监测肿瘤体积和小鼠体重变化,测量肿瘤和各脏器质量,ELISA法检测脾细胞分泌IL-12和IFN-γ的水平,Real-time PCR检测肿瘤组织中IFN-γ和IL-17AmRNA的相对表达量.结果:MBP能抑制肿瘤的生长(P＜0.05).与PBS组相比,MBP组小鼠脾细胞中IL-12、IFN-γ分泌量上升,肿瘤组织中IFN-γ mRNA的表达量上升,IL-17A mRNA的表达量下降(P＜0.05).结论:MBP能够有效抑制肝癌H22肿瘤生长,其作用可能是通过激活Th1型免疫反应和抑制Th17型免疫反应.
关键词： 麦芽糖结合蛋白 小鼠肝癌H22荷瘤模型 Th1 Th17 -
亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白
目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinant maltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP).用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验.方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1 (pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性；直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度；蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度.结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57kD,与预期结果一致；亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5％,浓度可达0.625g/L.结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP.
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大肠杆菌麦芽糖结合蛋白激活TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径诱导Th1活化
目的 探讨TLR2/TLR4介导的信号通路在大肠杆菌麦芽糖结合蛋白诱导Th1活化中的调控作用.方法 免疫磁珠分选方法获取纯的CD4+T细胞,经CD3/CD28抗体活化后的CD4+T细胞分别用MBP、MBP+anti-TLR2、MBP+anti-TLR4刺激.ELISA检测培养上清中IFN-γ和IL-4的分泌;RT-PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的mRNA表达;Western blotting方法检测CD4+T细胞MyD88、TRIF、TRAF3和TRAF6的蛋白表达.结果 MBP组IFN-γ水平升高、IFN-γ、MyD88、TRIF、TRAF3的rnRNA上调、TRAF6的mRNA下调;MBP+anti-TLR2组IFN-γ水平降低、TRAF6的mRNA上调、MyD88的mRNA下调、TRIF、TRAF3的mRNA无影响;MBP+anti-TLR4组IFN-γ水平升高、TRAF6的mRNA上调、MyD88、TRIF、TRAF3的mRNA下调,Western blotting实验也出现了相似的结果.结论 TLR2介导的MyD88依赖途径和TLR4介导的TRIF/TRAF3依赖途径在MBP诱导的Th1活化过程中发挥了重要的调控作用.
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人PPARαLBD融合蛋白表达质粒的构建和诱导条件优化
过氧化物酶体增殖物活化受体α(Peroxisome prolifterator- activated receptor α,PPARα)属于Ⅱ型核受体,通过其配体结合区(1igand binding domain,LBD)结合特定的激动剂对参与机体代谢的关键酶、受体等的表达起调节作用.本研究以人肝组织总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出人PPARαLBD基因的cDNA片段,将其插入表达载体pMAL-p2X的麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)编码基因malE的下游,转化入宿主菌E. coli.TB1.然后对重组质粒在大肠杆菌TB1中的表达条件进行了优化.经SDS-PAGE分析和Bio-Rad Quantity One凝胶影像分析结果表明,诱导剂IPTG的浓度为0.4 mmol/L,30℃振荡诱导培养6 h时,可获得高效表达的MBP-PPARαLBD融合蛋白,重组蛋白的表达量可达胞质总蛋白的31.34%.为进一步纯化和PPARα配体筛选研究打下了良好的基础.
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N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性
将菌株 SS-ori的 N-氨甲酰- D-氨基酸酰胺水解酶基因( Dcase)插入到 pMAL- c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白( MBP)与 Dcase融合的重组子.该重组子在 E.coli BL21中的表达产物为融合蛋白 MBP- Dcase (76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的 19%.经 Amylose亲和纯化和 Superose 12凝胶排阻层析后达到了电泳纯.根据 pMAL- c2X的背景,用 Factor Xa剪切后,可得约 41.7ka的 MBP和 34.7ka的 Dcase.酶活性检测表明当用 N-氨甲酰- DL-缬氨酸做为底物 ,A600=10时,每升菌体每小时可产生 D-缬氨酸 0.78g.
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通过与MBP融合提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达
目的探讨提高单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达的途径.方法通过融合大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(mbp)基因到抗人纤维蛋白单链抗体(seFvIIn)和抗结肠癌相关抗原单链抗体(ScFvSC11)的5′端,或者同时融合人抗体κ轻链恒定区(HuC κ)基因到单链抗体的3′端,构建成表达载体,在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白的可溶性表达水平.结果与MBP融合表达可在大肠杆菌胞浆内得到可溶性的高表达,表达量占全菌蛋白的20%左右;同时融合表达HuC κ,融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量占全菌蛋白的30%左右.结论与MBP及HuC κ融合表达可以明显提高含单链抗体的融合蛋白在胞浆内的可溶性表达量.
