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人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达
目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础.方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc 片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18 质粒载体上.然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A 真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体.经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达.结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50 μg/1×106细胞.结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA 基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据.
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携带人二氢叶酸还原酶基因慢病毒表达载体构建及鉴定
目的:构建携带人二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的慢病毒表达载体pWPI.方法:采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA 全长,与EZ-T克隆载体连接,HindIII及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口.慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因.表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒.结果:成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100％,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达.结论:成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础.
关键词： dhfr 慢病毒载体 Pwpi 293T 细胞 -
稳定表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原CTLA-4的293T细胞株的建立
目的：构建稳定表达细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4， CTLA-4）的293T 细胞株。方法首先从人外周血获取 PBMC 加以 T 细胞活化； PCR 扩增 CTLA-4转录本，连接pUCm-T 质粒引入 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切位点后转入真核细胞表达质粒 pcDNA3．1；重组质粒 pcDNA3．1-CTLA-4经脂质体转染293T 细胞，以抗生素 G418筛选表达 CTLA-4的293T 细胞；定量 PCR、免疫荧光分别检测293T 细胞 CTLA-4表达与细胞定位。结果血样来源 T 细胞经活化后表达 CTLA-4转录本。 HindⅢ和EcoRⅠ双酶切证实重组质粒内 CTLA-4插入序列正确； RT-PCR 及免疫荧光检测证实293T 细胞能够稳定表达目的蛋白 CTLA-4，并定位于细胞膜表面。结论成功构建的 pcDNA3．1-CTLA-4重组真核表达载体，在293T 细胞膜表面实现了稳定表达，为进行相关生物学理论与应用研究打下基础。
关键词： T 淋巴细胞相关抗原-4 293T 细胞 基因克隆 真核表达 -
CXCR4基因慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定
目的：构建CXCR4基因慢病毒过表达载体并对其进行包装、鉴定。方法首先设计合成引物,采用PCR法扩增目的基因CXCR4,将目的基因与酶切线性化的载体进行定向交换,成功构建重组载体慢病毒表达载体pGC-FU-CXCR4,将其产物转化大肠杆菌感受态细胞。对培养出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,后将获得的病毒载体共同转染293T细胞,收集病毒颗粒,并采用Real time PCR法测定病毒滴度。结果 PCR鉴定结果显示扩增的目的基因已成功插入pGC-FU载体,Western Blot结果显示得到的片段与理论大小相符,阳性克隆测序结果与目的基因序列一致,说明重组慢病毒载体的插入序列完全正确。结论本实验成功构建了CXCR4慢病毒表达载体,并成功对慢病毒进行了包装及病毒滴度测定。
