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利用薄膜挤压法制备支撑脂双层膜
背景:人工支撑脂双层膜是接近细胞膜的体外仿生模型,构建结构与功能均类似于真实细胞膜的脂双层膜具有十分重要的意义.目的:探索表面均匀且流动性高的支撑脂双层膜的佳制备条件并检测指标.方法:采用薄膜挤压法,分别以孔径为0.1,0.2μm的滤膜对脂质体分子过滤10次,保留未过滤样品作为对照组,通过原子力显微镜对其表面粗糙程度进行检测,探讨制备均匀程度较高的脂双层膜所需滤膜的佳孔径.将160μL卵磷脂(10 g/L)分别与5,10,25μL荧光磷脂(1 g/L)进行混合,通过荧光漂白恢复技术对脂双层膜的流动性进行检测,探讨卵磷脂与荧光磷脂的适比例.结果与结论:原子力显微镜实验结果显示,经过孔径为0.1μm滤膜过滤所得的脂双层膜表面均匀程度高(P<0.01),其表面均方根粗糙度为(0.432±0.181)nm,当滤膜孔径大于0.1μm时,脂双层膜表面均匀程度差且存在较多的未铺展开脂质体囊泡.荧光漂白恢复实验结果显示,采用孔径为0.1μm滤膜过滤的脂双层膜荧光恢复程度高,当卵磷脂(10 g/L)与荧光磷脂(1 g/L)体积比为160:10时,采用孔径为0.1μm滤膜过滤的脂双层膜荧光恢复程度达到90%,且扩散系数大于1μm2/s,符合优质脂双层膜的标准.实验提示利用薄膜挤压法制备脂双层膜时,卵磷脂与荧光磷脂的适比例以及佳滤膜孔径.
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低密度脂蛋白诱导巨噬细胞Raw264.7脂质筏的聚集
目的:探究低密度脂蛋白(LDL)与脂质筏之间的关系.方法:运用荧光漂白恢复技术(FRAP),对LDL刺激的细胞和未经LDL刺激的细胞进行观测;采用密度梯度离心的方法分离脂质筏,对各层中胆固醇含量进行测定,通过Western Blot对脂质筏标志性蛋白flotillin-1,caveolin-1进行分析;β-环糊精孵育后,扫描电子显微镜观测细胞形态.结果:经LDL刺激的Raw264.7细胞表现出荧光漂白恢复时间延长;脂质筏区的胆固醇含量增多,脂质筏区标志性蛋白flotillin-1,caveolin-1增加;β-环糊精孵育后细胞形态发生改变,细胞胆固醇含量降低.结论:LDL能诱导细胞膜上脂质筏的聚集.
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荧光漂白恢复,荧光共振能量转移和荧光相关光谱检测的技术特点
荧光漂白恢复(FRAP)、荧光共振能量转移(FRET)和荧光相关光谱(FCS)是三种以荧光为基础的检测技术,常用来研究分子间相互作用.对三种技术的特点做以比较和讨论.
