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三维培养人多能干细胞的研究与进展
背景:人多能干细胞具有体外长期自我更新和分化为几乎所有体细胞类型的独特潜能,在细胞治疗、再生医学、药物筛选、毒理学测定、疾病建模和立体器官发生等领域有广泛的应用前景.传统体外二维培养方法难以获得大量的细胞,而三维培养技术为人多能干细胞的大规模生产开辟了一条新的途径.目的:对目前人多能干细胞三维培养的研究进展作一综述.方法:应用计算机检索PubMed和CNKI数据库2005年1月至今有关人多能干细胞三维培养的文章,英文检索词为"human pluripotent stem cells,three dimension culture,microcarrier,suspension culture,aggregates,hydrogel,microencapsulation,bioreactor system,pluripotency",中文检索词为"多能干细胞,三维培养",保留77篇文献进行分析.结果与结论:细胞聚集体、微载体和水凝胶是目前实验室三维培养多能干细胞的主要形式.与二维培养相比,三维培养可更高效地扩增细胞,提高细胞产量,为人多能干细胞临床应用奠定了良好的基础.
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Plasmocin对人多能干细胞支原体感染的消除研究
目的:探究应用Plasmocin消除人多能干细胞支原体感染时的佳浓度和所需天数,检测消除支原体感染后的人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)向神经元的定向分化.方法:应用25.0、12.5、8.5、5.0 μg/mL 4种不同浓度的Plasmocin进行支原体感染的消除,用PCR比较消除结果;对已消除支原体的hPSC进行维持培养以及定向分化.结果:应用4种浓度的Plasmocin均能消除支原体的感染,但其中高浓度组(25.0 μg/mL)出现细胞毒性反应,消除支原体后存活下来细胞较少,而低浓度组(5.0 μg/mL)消除支原体所需给药时间较长,12.5 μg/mL浓度组对细胞生长有不利影响,而8.5 μg/mL浓度组对细胞生长影响较小.hPSC在消除支原体感染后可高效分化至前脑神经元,并且9个月后未检测出支原体.结论:应用8.5 μg/mL的Plasmocin加药1周即可彻底消除hPSC中支原体的感染,并且不会对其定向分化能力造成影响.
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不同体外诱导分化来源巨噬细胞表型分子分析及极化功能比较
目的 探讨人多能干细胞(hPSC)、人脐血CD34+造血干/祖细胞与人白血病细胞系THP-1这3种来源巨噬细胞表型分子及其不同极化状态下炎症细胞因子mRNA相对表达水平,确定这3种来源巨噬细胞的功能.方法 选择上述3种来源巨噬细胞,包括hPSC与AGM-S3基质细胞共培养来源巨噬细胞、人脐血CD34+造血干/祖细胞来源巨噬细胞、THP-1来源巨噬细胞为研究对象.对其研究内容包括:①形态观察,并且进行麦格-姬姆萨(MGG)复合染色分析,判断巨噬细胞是否成功获得.②采用流式细胞术对其表型分子进行检测.③在脂多糖、白细胞介素(IL)-4刺激下,通过荧光定量PCR方法检测不同刺激物作用下其各种炎症细胞因子mRNA的相对表达水平,确定3种来源巨噬细胞的极化功能.采用独立样本t检验比较3种来源巨噬细胞不同刺激物作用下各种炎症细胞因子mRNA的相对表达水平.结果 ①根据细胞形态学观察及MGG复合染色结果,3种来源巨噬细胞均成功获得.②流式细胞术检测结果显示,3种来源巨噬细胞均表达髓系相关表型分子CD45、人类白细胞抗原(HLA)-Ⅱ、CD36与CD11b.另外,THP-1来源巨噬细胞仅表达巨噬细胞相关分子CD64与CD11c,而hPSC与AGM-S3基质细胞共培养来源巨噬细胞与人脐血CD34+造血干/祖细胞来源巨噬细胞,均高表达巨噬细胞相关表型分子CD14、CD64、CD11c、CD68、CD86、CD206.③荧光定量PCR结果显示,hPSC与AGM-S3共培养来源巨噬细胞在脂多糖刺激3h时,炎症细胞因子IL-1β、-6、-12β与肿瘤坏死因子(TNF)-α mRNA的相对表达水平达到峰值,分别为(14.69±0.24)、(305.50±67.26)、(10.91±1.48)、(128.31±9.90),均分别高于IL-4刺激3h时的(0.75±0.14)、(2.66±0.27)、(0.54±0.04)、(0.89±0.08),并且差异均有统计学意义(t=85.630、7.798、12.128、22.295,P=0.000、0.001、0.000、0.000).人脐血CD34+造血干/祖细胞来源巨噬细胞在脂多糖刺激9h时,IL-1β、-6 mRNA的相对表达水平达到峰值,分别为(16.80±0.56)、(481.50±26.81),均分别高于IL-4刺激9h时的(0.02±0.00)、(0.51±0.23),并且差异均有统计学意义(t=52.133、31.080,P=0.000、0.000);IL-12p与TNF-α mRNA相对表达水平在刺激3h时达到峰值,分别为(56.48±3.78)、(11.12±0.76),均分别高于IL-4刺激3h时的(3.53±0.46)、(0.33±0.18),并且差异均有统计学意义(t=24.090、24.010,P=0.000、0.000);THP-1来源巨噬细胞在脂多糖刺激3h时,TNF-α mRNA的相对表达水平达到峰值,为(21 388.05±2 464.90),高于IL-4刺激3h时的(143.89±5.30),并且差异有统计学意义(t=14.930,P=0.000);IL-1β、-6、-12p mRNA的相对表达水平在刺激9h时达到峰值,分别为(4.33±0.01)、(14.53±3.79)、(525.56±34.65),均分别高于IL-4刺激9h时的(0.48±0.08)、(0.01±0.00)、(1.03±0.26),并且差异均有统计学意义(t=82.710、6.640、26.220,P=0.000、0.003、0.000).3种来源巨噬细胞在脂多糖刺激下,均可以形成M1型巨噬细胞.IL-4刺激9h时,THP-1来源巨噬细胞IL-10 mRNA的相对表达水平为(262.79±20.18),显著高于脂多糖刺激的(1.71±0.02),并且差异有统计学意义(t=22.410,P=0.000).于IL-4刺激下,仅THP-1来源巨噬细胞可以被有效极化形成M2型巨噬细胞,而其他2种来源巨噬细胞,均不能被有效极化形成M2型巨噬细胞.结论 3种不同来源巨噬细胞具有显著表型分子表达差异,hPSC与AGM-S3共培养来源巨噬细胞与人脐血CD34+造血干/祖细胞来源巨噬细胞,可以表达更多的巨噬细胞相关表型分子;而THP-1来源巨噬细胞缺失部分巨噬细胞相关表型分子表达,不能完全模拟体内巨噬细胞表型分子表达情况.hPSC与AGM-S3共培养来源巨噬细胞与人脐血CD34+造血干/祖细胞来源巨噬细胞在较短刺激下,即可以分化成M1型巨噬细胞,但是无明显M2型极化.THP-1可在不同刺激下极化成M1与M2型巨噬细胞,但是所需刺激时间较长.
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人多能干细胞向造血细胞的体外诱导分化:方法和目标
由于方法的不同,人类多能干细胞(hPSCs)在体外产生的各种造血细胞的成熟度和功能存在偏差.我们实验室建立了高效的hPSCs与造血微环境基质细胞共培养产生大量造血干/祖细胞的方法.本专题就2种自然免疫相关细胞的早期发育和成熟,以及初期原始造血和成体造血的比较,建立了时序性地观察了hPSCs向造血细胞逐级诱导分化的方法.
