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以黑色素浓集荷尔蒙受体为靶点高通量筛选细胞模型的建立
背景:研究表明,激活黑色素浓集荷尔蒙(melanin concentrating hormone,MCH)受体可引起细胞内钙浓度的变化,通过检测钙浓度的变化可以反映受体的功能.目的:建立以MCHR为靶点的高通量筛选细胞模型.设计、时间及地点:对比观察,于2006-09/11在中国科学院北京基因组研究所药理组实验室完成.材料:人胎脑Total RNA购自STRATAGENE公司,经中国科学院北京基因组研究所药理组反转录为cDNA文库;人胚肾细胞系HEK293由中国医学科学院基础所细胞中心提供.方法:首先从人胎脑cDNA文库中得到MCHRl和MCHR2的全长cDNA,并将其克隆到pcDNA3.1载体中,构建人MCHR1,MCHR2基因的表达质粒,继而转染人胚肾293,通过G418筛选建立了稳定的表达人MCHR1和MCHR2的细胞株;进一步通过人MCHR的内源激动剂MCH及人MCHR1的特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175来检测细胞株的功能和稳定性.主要观察指标:通过对钙离了敏感的荧光指示剂Fluo-3,检测细胞内部反映钙离子浓度变化的荧光值,通过荧光值计算出反映受体活性的半数有效浓度EC50和半数抑制浓度IC50值,以及反映系统可靠性的Z因子.结果:实验建立了稳定表达MCHR1,MCHR2的高通量药物筛选细胞模型,对所建立细胞模型的功能、稳定性、特异性、高通量等特点进行检测.MCHR1细胞模型对MCH的Ecso值为173.72 nmol/L,对起特异性激动剂HD-01和拮抗剂ATC0175的EC50和IC50分别为37.42 nmol/L和13.6 nmol/L.而MCHR2细胞模型对MCH的EC50值为3 nmol/L,对HD-01和ATC0175则没有反应,MCHR1和MCHR2细胞模型的第1代和25代对激动剂和拮抗剂的反应是基本一样的.MCHR1和MCHR2细胞模型的Z因子为0.61和0.73,并对筛选条件进行了优化,确定_了实验系统中细胞的数量为3×104个/孔和二甲基亚砜的终浓度为不超过10 g/L系统佳.结论:采用钙流测定方法可成功建立稳定的MCHR1和MCHR2筛选细胞株及可靠的筛选方法,该细胞模型可同时用于人MCHR激动剂与拮抗剂的筛选.
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人MCHR1真核表达载体的构建
目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1(+)/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.
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MCHR1基因沉默对3T3-L1细胞诱导分化的影响
目的 运用RNA干扰技术沉默黑色素浓集激素受体1(Melanin-Concentrating Hormone Receptor 1,MCHR1)基因的表达,观察其对3T3-L1细胞诱导分化的影响,为肥胖症的基因治疗提供新思路.方法 用含绿色荧光蛋白的重组载体sh-MCHR1,通过脂质体法转染3T3-L1细胞.细胞诱导分化的同时用黑色素浓集激素(Melanin-Concentrating Hormone,MCH)干预,并在不同时点对脂滴进行油红O染色.采用RT-PCR以及Western blot分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor y,PPAR γ)、CCAAT/增强子结合蛋白-α(CCAAT/Enhancer-Binding Protein α,C/EBPα)和脂肪酸结合蛋白2(adipocyte protein 2,ap2) mRNA和蛋白的表达.结果 重组载体sh-MCHR1成功转染;与阴性转染组相比,sh-MCHR1转染组d 10后,油红O染液相对OD510值显著下降(P＜0.05);PPARγ、C/EBPα和ap2 mRNA的表达量分别在d6、d8和d8后显著下降(P＜0.05);3者蛋白的表达量均在d8后显著下降(P＜0.05).结论 shRNA沉默MCHR1基因可减缓3T3-L1细胞诱导分化,其可能通过抑制PPAR γ、C/EBPα和ap2的表达而实现.
