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血管紧张素Ⅱ对人星形胶质细胞老化的影响
目的 本研究通过体外细胞实验,拟探讨血管紧张素Ⅱ对人星形胶质细胞老化的影响.方法 血管紧张素Ⅱ不同剂量(1,10,100 nmol/L)刺激人星形胶质细胞3 d,或者相同剂量血管紧张素Ⅱ(100 nmol/L)不同时间(1、3、7 d)刺激人星形胶质细胞,利用β半乳糖苷酶染色评估细胞内细胞老化.100 nmol/L 血管紧张素Ⅱ刺激人星形胶质细胞0、15、30、60 min,利用二氢乙啡啶(DHE)染色评估活性氧产生.结果 血管紧张素Ⅱ剂量依赖性引起人星形胶质细胞DHE染色表达增多,在30 min 达到顶峰(P<0.01).血管紧张素Ⅱ(10,100 nmol/L)也剂量依赖性引起β半乳糖苷酶染色细胞增多(P<0.01).结论 本研究揭示血管紧张素Ⅱ剂量依赖性诱导人星形胶质细胞老化,提示在脑缺血损伤和老年退行性疾病进展期,血管紧张素Ⅱ引起活性氧产生和细胞老化的内在机制.
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蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白在人星形胶质细胞中穿膜能力和保护作用的研究
目的 观察蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白(protein transduction domain4-Cu,Zn superoxide dismutase fusion protein,PTD4-Cu,Zn-SOD)能否穿膜进入人星形胶质细胞、能否减轻人星形胶质细胞的缺氧损伤.方法 ①Western blot:从干预时间(15、30、60 min)和干预浓度(0.5、1.0、2.0 μmol/L)两个方面观察融合蛋白能否穿膜.②实验分组:制备细胞缺氧损伤模型,按完全随机法分为对照组、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)组(SOD组)和PTD4-Cu,Zn-SOD组(PTD4-SOD组),对照组加DMEM(dulbecco's modified eagle's medium,DMEM)培养基(不含血清),其余两组分别加入含有Cu,Zn-SOD和PTD4-Cu,Zn-SOD终浓度为2μmol/L的DMEM培养基,三组干预时间均为1h,用Annexin V/PI凋亡试剂盒流式测凋亡,观察融合蛋白能否减轻细胞缺氧损伤.结果 ①对照组各组未发现明显的蛋白条带,SOD组各个干预时间点(15、30、60 min)与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);PTD4-SOD组在15、30 min两个时间点与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);在干预60 min时与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).②对照组各组未发现明显的蛋白条带,SOD组的各个剂量(0.5、1.0、2.0 μmol/L)与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);PTD4-SOD组在0.5、1.0 μmol/L两个浓度与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05);在浓度为2 μmol/L时与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).③对照组的凋亡率为(27.03±0.50)％,SOD组凋亡率为(23.29±0.58)％,和对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);而PTD4-SOD组凋亡率为(12.06±0.19)％,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);PTD4-SOD组和SOD组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 ①PTD4-Cu,Zn-SOD能进入体外培养的人星形胶质细胞内;细胞内融合蛋白的量随着培养的时间和加入融合蛋白浓度的增加而增加.②融合蛋白PTD4-Cu,Zn-SOD能减轻人星形胶质细胞缺氧损伤后的凋亡.
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1,2-二氯乙烷通过线粒体通路诱导人星形胶质细胞凋亡研究
目的 通过筛选细胞凋亡差异表达蛋白,探讨1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)诱导人星形胶质细胞(HAs)凋亡的相关分子机制.方法 以终浓度分别为0 ～ 80 mmol/L或0～ 40 mmol/L的1,2-DCE染毒HAs,培养24h后,采用磷脂结合蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶流式细胞技术检测细胞凋亡,采用AAH-APO-1-2蛋白芯片筛选差异表达蛋白,采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证相关蛋白的差异表达基因.结果 在1,2-DCE浓度为0 ～ 80 mmol/L时,随着染毒剂量增加,HAs细胞总凋亡率升高,呈剂量-效应关系(P＜0.01).凋亡蛋白芯片筛选出7个差异表达蛋白,其中,与对照组比较,胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1、IGFBP-4和细胞色素C(Cyto C)表达均上调,P27、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2相互作用的细胞死亡中介物(BIM)和BH3交叉域死亡受体激动剂(BID)表达均下调.差异表达基因的qRT-PCR验证结果显示,40 mmol/L剂量组HAs中IGFBP-1、IGFBP-4和Cyto C的mRNA表达上调,与蛋白芯片的表达趋势一致;该组HAs中Caspase-3、BIM、BID的mRNA表达也上调.结论 1,2-DCE可能通过线粒体通路诱导HAs凋亡.
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1,2-二氯乙烷及其代谢产物对人星形胶质细胞毒性研究
目的 探讨1,2-二氯乙烷(1,2-DCE)及其体内代谢产物对人星形胶质细胞(HAs)的毒性.方法 取对数生长期的HAs建立离体细胞培养实验模型,分别采用不同剂量的1,2-DCE(5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 mmol/L)、2-氯乙醇(5.00、25.00、50.00、100.00、200.00 mmol/L)、2-氯乙醛(1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 mmol/L)和氯乙酸(0.01、0.05、0.10、0.50、1.00 mmol/L)对HAs进行染毒,培养24 h后,采用荧光倒置相差显微镜观察HAs形态,采用CCK-8比色法检测HAs的存活率和抑制率,估算24 h半抑制浓度(24 h-IC50),采用磷脂结合蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双标记流式细胞技术检测细胞的凋亡情况.结果 染毒24 h后,1,2-DCE、2-氯乙醇、2-氯乙醛和氯乙酸均可使HAs发生不同程度的改变,表现为胞体变小、伪足变尖、胞内颗粒增多,细胞透明度下降,圆形悬浮细胞增多.随着1,2-DCE、2-氯乙醇、2-氯乙醛和氯乙酸染毒剂量的增加,HAs的细胞存活率均下降(P<0.01),细胞抑制率均增加(P<0.01),均呈剂量-效应关系;上述4种受试物对HAs的24 h-IC50分别为56.25、235.00、26.43和1.38 mmol/L.1,2-DCE、2-氯乙醇和氯乙酸均可诱导HAs凋亡,HAs的凋亡率与上述3种受试物的染毒剂量均呈正相关(P<0.01).结论 1,2-DCE及其代谢产物2-氯乙醇、2-氯乙醛和氯乙酸均可对HAs造成毒性损伤,并可诱导HAs发生凋亡,以氯乙酸毒性作用强.
