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三邻甲苯磷酸酯暴露对鸡脊髓组织基因谱的影响
目的 从三邻甲苯磷酸酯(tri-orhto-cresyl phosphate,TOCP)暴露鸡的脊髓组织中筛选有机磷致迟发性神经病(organophosphorus ester induced delayed neuropathy,OPIDN)的相关基因,为进一步探讨OPIDN的发病机制提供目的基因谱.方法 罗曼鹤母鸡(Roman hens)随机分为TOCP组、先给苯甲基磺酰氟(phenylmethanesul fonyl fluoride,PMSF)再给TOCP的PMSF前干预组、生理盐水对照组,每组4只.染毒5d处死实验鸡,低温取脊髓,依次提取总RNA、纯化、转录合成cRNA探针、标记生物素、基因芯片杂交、扫描杂交信号、后进行基因芯片处理和分析.结果 TOCP组与对照组相比有显著差异,并与PMSF前干预组无显著差异的基因有520个,其中表达差异在3倍以上基因有36个.结论 从TOCP暴露鸡脊髓组织中筛选出520个OPIDN相关基因,其中36个基因可能为OPIDN密切相关基因.
关键词： 有机磷致迟发性神经病 基因谱 三磷甲苯磷酸酯 苯甲基磺酰氟 脊髓 -
三邻甲苯磷酸酯暴露鸡脊髓组织中Cofilin-1b的差异表达
目的 从三邻甲苯磷酸醣(TOCP)暴露鸡的脊髓组织中筛选可能与调控微丝解聚作用相关的差异表达蛋白,为探讨有机磷化合物诱发的迟发性神经毒性(OPIDN)作用机制提供靶蛋白依据.方法 42只罗曼鹤母鸡随机分成1000 mg/kg TOCP组、预先给予40 mg/kg苯甲基磺酰氟(PMSF)后再投1000 mg/kg TOCP的干预组和生理盐水对照组,每组14只.染毒第5和20天,每组分别处死4只鸡,低温环境下分离脊髓,提取总蛋白.利用双向电泳结合质谱分析技术,筛选和鉴定可能与调控微丝解聚作用相关的差异表达蛋白.结果 TOCP组鸡于染毒第7日前后出现进行性共济失调和肌无力等OPIDN典型症状,起病从下肢远端部分开始且病变程度随时间逐渐加重直至全瘫,而其他组鸡在实验观察期间未见OPIDN症状.TOCP组鸡于暴露第5天,分别与对照组和PMSF前干预组比较,其脊髓组织肌动蛋白解聚因子Cofilin-1b分别下调3.4倍和2.8倍,且有统计学意义(差异表达＜0.5或差异表达＞2),而PMSF前干预组与对照组比较,鸡脊髓组织Cofilin-1b的表达差异无统计学意义.在TOCP暴露第20天,TOCP组鸡脊髓组织Cofilin-1 b表达与其他两组比较尽管有下降趋势,但无显著性变化.结论 TOCP暴露能导致鸡脊髓神经组织Cofilin-1b表达在早期显著下调,且该蛋白表达下调可能与微丝骨架结构紊乱及其OPIDN诱发机制有关.
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PMSF对TOCP诱导的母鸡大脑中神经丝含量的变化
目的 研究苯甲基磺酰氟(PMSF)阻断有机磷诱导的迟发性神经病(OPIDN)母鸡大脑中神经丝(NFs)的动态变化和机制.方法 成年母鸡随机分为正常对照组、磷酸三邻甲苯酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)组和PMSF+TOCP组,Western-blotting检测母鸡染毒后第1、5、10和21天大脑中高分子量神经丝蛋白(NF-H)、中分子量神经丝蛋白(NF-M)、低分子量神经丝蛋白(NF-L)3种神经丝蛋白的相对含量.结果 TOCP染毒后母鸡出现OPIDN症状,大脑中NFs含量明显改变,且大脑沉淀中比上清中变化更加明显.总的趋势是从第1天开始降低,第10天达到低,第21天有所恢复.大脑沉淀中NF-L、NF-M和NF-H在第10天分别降低了86.22%(P＜0.01),86.98%(P＜0.01),54.05%(P＜0.05).提前24 h给予PMSF后,与正常对照相比,母鸡未出现明显OPIDN症状,大脑上清和沉淀中NF-L和NF-M均无明显变化,NF-H有所增加,在沉淀中第5天增加多达109.05%(P＜0.01).沉淀中PMSF+TOCP组NF 3个亚单位比TOCP组在各时间点均有不同程度的增加.结论 TOCP染毒引起母鸡大脑中NFs紊乱,提前给予PMSF能够抑制这种变化,提示TOCP诱发的NF紊乱可能是OPIDN发生的一种机制.
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三邻甲苯磷酸酯染毒母鸡神经组织中自噬相关蛋白ATG4表达与磷酸化的变化
目的 研究三邻甲苯磷酸酯(TOCP)染毒母鸡以及提前应用苯甲基磺酰氟(PMSF)后神经组织中自噬相关蛋白ATG4A与p-ATG4A表达的变化,探讨迟发性神经病(OPIDN)的发病机制.方法 选取成年罗曼母鸡60只,其中30只动物用于TOCP染毒实验,即动物随机分为对照组,1、5、10、21 dTOCP染毒组,剂量为600 mg/kg,一次性灌胃染毒.另外30只动物随机分为对照组,1、5、10、21 d PMSF干预组,提前24 h皮下注射90 mg/kg PMSF,然后再染毒600 mg/kg TOCP,用免疫印迹法检测胫神经ATG4A与p-ATG4A的相对含量.结果 与对照组比较,TOCP染毒后第1、5、10天胫神经ATG4A含量分别下降36％、43.7％,41％,染毒后第1、5、10天胫神经p-ATG4A含量分别下降22.5％、25％,21％差异有统计学意义(P＜0.05).PMSF干预组动物胫神经中ATG4A 、p-ATG4A与对照组相比没有明显改变.结论 TOCP染毒后干扰了自噬相关蛋白ATG4A、p-ATG4A表达的变化,可能与OPIDN中神经元自噬活性变化有关.
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PMSF对TOCP暴露鸡腰髓组织蛋白表达谱影响
目的 从三邻甲苯磷酸酯(TOCP)暴露鸡的腰髓组织中筛选迟发性神经毒性(OPIDN)相关差异表达蛋白点,为进一步质谱分析提供依据.方法成年罗曼鹤母鸡24只,随机分成1 000 mg/kg TOCP组,先给40 mg/kg苯甲基磺酰氟(PMSF)后24h再投1 000 mg/kg TOCP组(PMSF干预组)和给予生理盐水的对照组,每组8只.染毒后5d天处死动物,分离腰髓后提取总蛋白；通过双向凝胶电泳获得完整的全蛋白质图谱,运用图像分析软件(Im-ageMaster2D)对银离子染色的电泳图谱进行分析.结果根据PMSF的作用特点,在TOCP组中选择与对照组比较差异有统计学意义,与PMSF干预组差异无统计学意义的蛋白匹配点,共获得上调点23个,下调点113个,其中＞4倍的上调点9个,＞4倍的下调点11个.结论TOCP暴露鸡腰髓组织中9个上调点和11个下调点的差异表达蛋白与其迟发性神经毒性可能密切相关.
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磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响
背景：有机磷化合物诱导的迟发性神经毒性发生的确切机制不清楚而尚无有效的治疗方法。目的：观察磷酸三邻甲苯酯对鸡脑组织谷氨酸/谷氨酰胺循环及其关键酶表达的影响。
方法：成年罗曼母鸡24只随机分为3组，每组8只。①磷酸三邻甲苯酯染毒组剂量为1000 mg/kg，经灌胃一次性给予实验鸡。②苯甲基磺酰氟干预组先将苯甲基磺酰氟按40 mg/kg剂量给鸡皮下注射，24 h后，再经灌胃一次性给鸡1000 mg/kg的磷酸三邻甲苯酯。③对照组则给予等量安慰剂。每组于5 d和21 d时间点各处死4只鸡，迅速取脑于-80℃深冻冰箱保存。ELISA 法检测谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺酶含量及谷氨酰胺合成酶活性，应用相应的试剂盒对细胞外谷氨酸和谷氨酰胺浓度进行测定，利用Fluo3-AM检测细胞内钙离子浓度。
结果与结论：磷酸三邻甲苯酯在暴露早期(5 d)可诱导鸡脑组织谷氨酰胺合成酶和谷氨酰胺含量及谷氨酰胺合成酶活性显著下降；谷氨酸和细胞内钙离子浓度显著升高。提示谷氨酰胺合成酶活性抑制所导致的谷氨酸/谷氨酰胺循环障碍和钙离子浓度显著升高可能与磷酸三邻甲苯酯暴露鸡诱发的迟发性神经毒性机制密切相关。 -
磷酸三邻甲苯酯诱导鸡迟发神经毒性模型和苯甲基磺酰氟的预处理
背景：接触有机磷化合物可导致迟发神经病的发生，然而因为迟发性神经病发生的确切机制不清楚而尚无有效的治疗方法。目的：构建磷酸三邻甲苯酯诱导鸡迟发性神经毒性模型并观察苯甲基磺酰氟预处理的影响。方法：将成年罗曼母鸡随机分为2个磷酸三邻甲苯酯染毒组，苯甲基磺酰氟预处理组和对照组。其中磷酸三邻甲苯酯染毒组浓度分别为1000 mg/kg和750 mg/kg，均一次性灌胃；苯甲基磺酰氟预处理组先将苯甲基磺酰氟按40 mg/kg剂量给鸡皮下注射，24 h后，再经灌胃一次性给鸡1000 mg/kg的磷酸三邻甲苯酯；而对照组则给予等量生理盐水。使用6分制来评价迟发性神经病临床症状并记录鸡的体质量变化。在染毒第5，21天分别断头处死鸡，制备电镜切片并于电镜下观察。结果与结论：磷酸三邻甲苯酯染毒后鸡临床症状随着时间的延长而渐进性加重(P <0.05)，体质量显著降低(P <0.05)，但苯甲基磺酰氟预处理组鸡与对照组鸡实验期间则无任何迟发性神经病异常表现和体质量变化。磷酸三邻甲苯酯组染毒5 d后，发现一些线粒体有轻微肿胀，轴突内微丝微管排列发生可疑改变，但是其他细胞器没有明显异常改变。磷酸三邻甲苯酯组染毒21 d后，脑神经元退行性改变明显，内质网肿胀，线粒体异常改变，细胞骨架排列紊乱。1000 mg/kg的磷酸三邻甲苯酯为佳染毒剂量。结果显示，实验成功建立了磷酸三邻甲苯酯诱导鸡迟发性神经毒性模型和苯甲基磺酰氟预处理模型，苯甲基磺酰氟预处理能明显改善磷酸三邻甲苯酯染毒后鸡迟发性神经病的临床症状和病理改变。
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苯甲基磺酰氟对有机磷化合物诱导的迟发性神经毒性的影响
[目的]为进一步解析苯甲基磺酰氟 (PMSF)对有机磷化合物 (OP)诱导的迟发性神经毒性 (OPIDN)的影响提供依据.[方法]80只单冠白色leghorn种雌性成鸡被分成17组.除了30 mg/kg 溴苯磷(leptophos)组和40 mg/kg三甲基苯基磷酸酯(TOCP)组为10只鸡外,其余组均为4只.OP染毒后各组鸡是否出现OPIDN症状要连续观察25 d,并对其临床症状的评分值进行分析比较.[结果] OP暴露后第25天,各组鸡的迟发性神经毒性症状观察结果显示,30 mg/kg leptophos组、30 mg/kg leptophos染毒后再给60 mg/kg PMSF组、40 mg/kg TOCP组和40 mg/kg TOCP染毒后再给60 mg/kg PMSF组的鸡出现了迟发性神经毒性症状,其临床症状的评分值分别为4.2、5.5、3.0和4.5. 同时给予30 mg/kg leptophos和1 mg/kg PMSF组、 40 mg/kg TOCP和1 mg/kg PMSF组鸡也出现了迟发性神经毒性症状,其临床症状的评分值分别为0.8和1.2,明显低于30 mg/kg leptophos组和40 mg/kg TOCP组(P<0.05或P<0.01).5 mg/kg leptophos染毒后再投予30 mg/kg leptophos组和5 mg/kg TOCP染毒后再投予40 mg/kg TOCP组的鸡则出现较重的迟发性神经毒性症状,其评分值分别达6.0和4.0.[结论]OP染毒前给予PMSF能防止诱发OPIDN,后给予PMSF时能增强OP的OPIDN.同时给予PMSF和OP时是否诱发OPIDN,取决于PMSF和OP的暴露浓度比例.两次OP染毒之间给予PMSF时,同样能预防OP诱发OPIDN.
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三磷甲苯磷酸酯暴露对鸡脊髓神经中髓鞘碱性蛋白表达的影响
[目的]探讨有机磷化合物（organophosphorvs compounds,OPs）引起迟发型神经毒性（organophosphorus esterinduced delayed neuropathy,OPIDN)后鸡的神经组织中髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）表达的变化.[方法]罗曼鹤母鸡48只,随机分成染毒组:给予1000 mg/kg三磷甲苯磷酸酯(tri - ortho - cresyl phosphate,TOCP)、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesul fonyl fluoride,PMSF）前干预组:在染毒组之前给予40 mg/kg PMSF和对照组（生理盐水）,每组16只.染毒第5天和第20天,每组分别处死8只动物,低温环境下分离腰髓,提取总蛋白.用双向电泳和质谱分析技术,筛选可能与脱髓鞘相关的差异表达蛋白.[结果]经双向电泳和质谱分析表明,在染毒第5天TOCP组及PMSF前干预组MBP变化与对照组比较,差异无显著性意义；第20天与对照组比较,TOCP组与PMSF前干预组的MBP表达分别为0.3667与0.7601（比值在0.5 ～2之间无意义）,前者表达下调达2.7倍,差异有显著性意义,后者差异无显著性意义.[结论] TOCP暴露诱导鸡脊髓神经组织MBP表达显著下调,其变化可能与OPIDN模型动物神经组织的脱髓鞘现象有关.
