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1 仪器与试药
长春花提取液；长春花(海南省)；长春新碱和长春碱标准品。甲醇,磷酸,二乙胺,乙醇,超纯水,硅胶。大孔树脂：D101,D102,AB-8,D-3520,HPD-100。JY92-2D型超声波细胞粉碎机,高效液相色谱仪(日本日立公司),DF-101S型恒温加热磁力搅拌器,SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵,ALC-210.3型电子天平,800B台式离心机。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱分析
色谱条件：采用Diamonsi1TM C18色谱柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm,迪马公司)；流动相为甲醇-水-二乙胺(700∶295∶5),磷酸调pH＝7；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为297 nm；进样量为20 μL。长春新碱标准曲线方程为：A＝3×107C－12 292(r＝0.999 5),线性范围2.0～20.0 μg/mL；长春碱标准曲线方程为：A＝2×107C－78 105(r＝0.999 6),线性范围5.0～30.0 μg/mL。
2.2 长春碱和长春新碱分离纯化工艺的优选
2.2.1 长春花提取液的制备
以长春花全草为原料,提取长春总碱主要采用超声法,最佳工艺为：90%甲醇水溶液作溶剂、浸泡时间为16 h、超声温度为40 ℃、功率为600 W、超声30 min。长春新碱和长春碱的提取率可达到90.14%和79.26%。由于药液浓度直接影响树脂的吸附效果,根据Langmuir单分子层理论[7],树脂的吸附量与药液的浓度在一定范围内成正比,因此,根据预试验,选择最佳药液浓度为17.95 mg/mL,其中长春新碱8.11 mg/mL,长春碱6.12 mg/mL。
2.2.2 树脂的筛选
选择大孔吸附树脂分离有效成分时利用其吸附的可逆性[8-10]。根据“相似相溶”原理,脂溶性成分如生物碱等应选用非极性或弱极性树脂,因此,预选D101、D102、AB-8、D-3520、HPD-100共5种树脂。
2.2.3 树脂的预处理
取以上树脂,分别在提取器内加入高于树脂层10 cm的80%乙醇,浸渍4 h后用80%乙醇淋洗,至流出液用一定量的水稀释不混浊,再用水反复洗涤至乙醇含量小于1%。用2 BV的5%HCl溶液,以4 BV/h的流速通过树脂层,并浸泡4 h后,用水洗至中性,再用2 BV的2%Na0H溶液,同法洗至中性备用。
2.2.4 静态吸附试验
精密称取预处理后树脂,每份含干燥树脂5.0 g,分别加入长春花提取液50 mL,在常温磁力搅拌下吸附12 h,过滤,测定不同树脂滤液中长春碱和长春新碱的含量。将各过滤后树脂中加入70%乙醇50 mL,放置12 h,过滤得解析液,同法测定含量。计算树脂对长春碱和长春新碱的吸附能力,公式：A吸＝C1V1－C2V2/W,其中A吸为树脂比吸附量(mg/g), C1为提取液有效成分含量(mg/mL),V1为提取液体积(mL),C2为滤液有效成分含量(mg/mL),V2为滤液体积(mL),W为树脂质量(g)。A解＝C3V3/WA吸,其中A解为树脂解吸率(%),C3为解析液中有效成分含量(mg/mL),V3为解析液体积(mL)。结果见表1。以优选AB-8型树脂为最佳。
2.2.5 动态吸附试验
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),湿法装入2.1 cm×40 cm的柱子中,不断加入长春花提取液,吸附流速为2 BV/h,每试管收集5 mL流出液。HPLC测定长春碱和长春新碱的含量,结果见图1。由图1可知,当流出液体积为100 mL时长春碱的泄漏量开始增大,流出液体积为125 mL时长春新碱的泄漏量显著增大,根据公式P吸＝(C前－C后)V吸/W,其中P吸为树脂比吸附量(mg/g), C前为吸附前提取液有效成分含量(mg/mL),C后为吸附后溶液有效成分含量(mg/mL),V吸为吸附溶液体积(mL),W为树脂质量(g),确定树脂最佳比上柱量为68.36 mg/g。
2.2.6 洗脱中乙醇浓度的考察
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),取长春花提取液50 mL,吸附流速为2 BV/h,分别选择80%、85%、90%、95%,100%乙醇洗脱,洗脱流速为1.5 BV/h,收集洗脱液,HPLC检测,并计算洗脱能力：E＝C洗V洗/W,其中E为比洗脱量(mg/g),C洗为洗脱液中有效成分含量(mg/mL),V洗为洗脱液体积(mL),W为树脂质量(g)。由图2可知,随着乙醇浓度逐渐增大,长春新碱的比洗脱量也不断上升,90%时达到最大；乙醇浓度在85%和90%时长春碱的比洗脱量较高且基本持平,因此,考虑成本及误差,选择90%乙醇溶液作为长春碱和长春新碱的洗脱剂。
2.2.10 硅胶纯化工艺及结果
将大孔吸附树脂分离后的长春总碱(含量为76.4%)采用硅胶柱进一步纯化。优选二氯甲烷-甲醇＝20∶1作为长春碱的洗脱剂,15∶1作为长春新碱的洗脱剂,HPLC检测(见图6～图8),得长春碱纯度97.26%,收率61.12%；长春新碱纯度94.18%,收率58.50%。
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