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MAT2A siRNA对荷瘤鼠肝癌细胞生长的影响
目的 探讨MAT2A小干扰:RNA对荷瘤鼠肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将MAT2A小干扰RNA质粒表达载体转染人肝癌细胞系Bel-7402细胞,建立持续转录小干扰RNA的细胞系,并将该细胞系皮下接种裸鼠,观察肿瘤生长情况;为进一步观察裸鼠体内抑瘤性,将皮下接种稳定表达小于扰RNA的Bel-7402细胞系的裸鼠分为三组:A、盐水对照组,B、空质粒对照组,C、siRNA治疗组;于接种后第12天,每组动物行纯化质粒DNA瘤内注射,观察肿瘤大小;治疗后2周,处死所有动物,取肿瘤,测量大小;部分石蜡包埋切片、HE染色,部分进行凋亡检测.结果 得到稳定转染siRNA载体、并能持续表达siRNA的Bel-7402细胞系,将稳定建系的细胞传代,持续表达siRNA细胞系肿瘤细胞生长明显缓慢.皮下接种建系的Bel-7402细胞建立荷瘤鼠模型,可以观察到siRNA组肿瘤生长缓慢,平均第13天才长出皮下可及、但肉眼看不到的肿瘤,而接种control siRNA组,平均第9天可长出肉眼可见的肿瘤;用裸鼠肿瘤模型观察siRNA的体内抑瘤效果,质粒DNA注射后,对照组瘤体10.93mm3,空质粒对照组为11.13 mm3,而siRNA质粒转染组为4.26 mm3(P＜0,01);HE染色显示,对照组和空质粒组质粒DNA注射后,病灶充满肿瘤细胞;而siRNA组质粒DNA注射后,病灶内有大量炎性细胞浸润,坏死明显,仅见少量肿瘤细胞;且siRNA明显诱导荷瘤鼠肝癌细胞凋亡,其凋亡指数为(28.79±2.13)%,较盐水对照组(9.54±1.89)%和空质粒治疗组(10.24±2.06)%明显升高(t=15.41,P＜0.01).结论 靶向MAT2A基因的siRNA诱导荷瘤鼠肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长.
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肝癌细胞MAT2A基因小干扰RNA靶位筛选体系的建立
目的:构建MAT2A基因的小干扰RNA(siRNA)快速筛选体系,筛选出有效的小干扰RNA.方法:首先构建能产生MAT2A基因小干扰RNA的质粒表达载体,细胞内转录合成4条小干扰RNA;然后构建MAT2A基因与荧光素酶报告基因(luciferase)的融合质粒表达载体plucF-MAT2A采用脂质体转染法将plucF-MAT2A与产生siRNA的质粒共转染293T细胞,定量测量荧光素酶活性,构建MAT2A基因的小干扰RNA筛选体系,初步筛选出抑制荧光素酶表达的有效siRNA;然后将有效的siRNA转染Bel-7402肝癌细胞,半定量RT-PCR检测MAT2A mRNA表达,并检测转染后肝癌细胞MAT的活性,进一步证实siRNA对MAT2A表达的抑制效果.结果:所合成的4条小干扰RNA中有2条抑制荧光素酶表达,抑制效率分别为81%和89%,并特异性抑制肝癌细胞MAT2A mRNA表达,降低了肝癌细胞中MAT活性.结论:通过荧光素酶报告体系来检测siRNA有效性的方法为RNAi研究提供了一个快速有效地筛选小干扰RNA的途径.
