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结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性研究
目的 通过比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异,探讨Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性的相关性. 方法 分别提取卡介苗菌株(BCG)、结核分枝杆菌国际标准无毒珠(H37Ra)、结核分枝杆菌国际标准强毒珠(H37Rv)、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株总RNA,并进行纯度鉴定.运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达,比较分析不同毒力结核分枝杆菌Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达差异. 结果 H37Rv菌株和新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株与BCG菌株相比,Pup基因表达分别上调1.67、2.65倍,Dop基因表达分别上调2.42、3.69倍,PafA基因表达分别上调4.09、7.36倍,Mpa基因表达分别上调2.65、3.91倍,差异有统计学意义(P＜0.05);BCG、H37Ra、H37Rv菌株与新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株相比,Pup基因表达分别下调62％、59％、37％倍,Dop基因表达分别下调63％、64％、34％倍,PafA基因表达分别下调87％、86％、44％倍,Mpa基因表达分别下调64％、67％、32％倍,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 在BCG、H37Ra、H37Rv、新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株Pup、Dop、PafA和Mpa基因的表达有差异性,且与菌株毒力呈正相关.Pup-蛋白酶体系统与不同毒力结核分枝杆菌致病性具有相关性.
关键词： 结核分枝杆菌 Pup-蛋白酶体系统 致病性 毒力 -
结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株的构建
目的 利用SOE-PCR技术和T载体技术,快速构建结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定基础. 方法 基于同源重组原理,利用SOE-PCR技术和T载体技术分别将各待缺失基因的上下游同源臂与卡那霉素抗性基因融合,构建各基因缺失突变盒;将各基因缺失突变盒与T-Vector pMD 19 (Simple)相连接,构建各基因缺失突变自杀载体;利用电穿孔技术将各载体转入H37Rv菌株,通过筛选阳性克隆、菌落PCR鉴定、DNA测序及遗传稳定性检测,获得各目的基因的缺失突变株. 结果 成功构建了带有1 601 bp的特异性置换片段Pup-N-K和1 591 bp的特异性置换片段K-Pup-C的Pup基因缺失突变株H37Rv△Pup,带有1 604 bp的特异性置换片段Mpa-N-K和1 602bp的特异性置换片段K-Mpa-C的Mpa基因缺失突变株H37Rv△Mpa,带有1 515 bp的特异性置换片段Dop-N-K和1509 bp的特异性置换片段K-Dop-C的Dop基因缺失突变株H37Rv△Dop及带有1 590 bp的特异性置换片段PafA-N-K和1 584 bp的特异性置换片段K-PafA-C的PafA基因缺失突变株H37Rv△PafA,且各突变株均具有良好的遗传稳定性. 结论 利用SOE-PCR技术和T载体技术可以快速构建结核分枝杆菌基因缺失突变株,依据此方法成功构建了H37Rv菌株Pup-蛋白酶体系统Pup基因、Mpa基因、Dop基因和PafA基因缺失突变株,为进一步研究结核分枝杆菌Pup-蛋白酶体系统的功能奠定了基础.
关键词： 结核分枝杆菌 Pup-蛋白酶体系统 缺失突变株 构建 -
结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与耐药结核杆菌耐药性的相关性研究
目的：检测不同耐药的结核杆菌临床分离株原核类泛素蛋白-蛋白酶体系统（以下简称：Pup-蛋白酶体系统）相关的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达水平，探讨研究结核杆菌Pup-蛋白酶体系统与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性的相关性。方法：以培养对数生长期的新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株为研究对象，分别提取结核杆菌临床分离的药物敏感菌株、单纯耐异烟肼的结核杆菌临床分离株（ INH-MTB）、单纯耐利福平的结核杆菌临床分离株（RFP-MTB）、单纯耐链霉素的结核杆菌临床分离株（SM-MTB）、单纯耐乙胺丁醇的结核杆菌临床分离株（EB-MTB）、耐多药结核杆菌临床分离株（ MDR）等各组菌株的总RNA，经纯度鉴定后，利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，检测各组结核杆菌菌株的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达水平，分析各组耐药结核杆菌临床分离株Pup-蛋白酶体系统相关的Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性的相关性。结果：与药物敏感菌株相比，Pup、Mpa基因在单一耐药菌株和耐多药菌株中表达有不同程度的下调，Dop、PafA基因在单一耐药菌株和耐多药菌株中表达有不同程度的上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。与MDR相比，Pup、Dop、Mpa基因在单一耐药菌株中表达有不同程度的上调，PafA基因在单一耐药菌株中表达有不同程度的下调，差异有统计学意义（ P＜0.05）。结论：在结核杆菌临床分离的药物敏感菌株、INH-MTB组、RFP-MTB组、SM-MTB组、EB-MTB组和MDR组中，结核杆菌Pup、Dop、PafA、Mpa基因的表达差异，与新疆地区广泛流行的耐药结核杆菌临床分离株耐药性有相关性。
关键词： 结核杆菌 耐药性 Pup-蛋白酶体系统
