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胶原样区文献资料
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人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素(MBL)胶原样区(CLR)蛋白.方法:应用PCR技术,从含中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段, 将其克隆至pET32a原核表达载体后, 转化E.coli BL21(DE3)感受态菌株诱导表达CLR蛋白.通过Ni2+-NTA 琼脂糖柱层析纯化目的蛋白, 以SDS-PAGE、 Western blot和ELISA法进行鉴定.结果:从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180 bp的DNA片段.构建的重组表达载体经BamH I和Hind Ⅲ酶切后出现约5 900 bp和180 bp的片段, 测序结果同预期的结果完全一致.重组质料在大肠杆菌中诱导表达后, 纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30 000、 60 000和120 000的3条带.Western blot分析表明, 3条蛋白带均可与抗His抗体起反应, 3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体.ELISA检测证实, 纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合.结论:获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白, 为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件.
