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pTWIN1质粒文献资料
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AcAPc2自剪切融合蛋白表达载体pTWIN1-AcAPc2的构建和表达
为表达和获取具有抗凝血功能的犬钩虫抗凝血肽(AcAPc2 ),采用搭桥PCR方法合成犬钩虫抗凝血肽全长双链cDNA序列,AcAPc2 cDNA全序列连入表达载体pTWIN1上构建成具有蛋白自剪切功能的表达载体pTWIN1-AcAPc2,将阳性重组子转入表达型大肠杆菌E.coli ER2566进行表达.表达的融合蛋白AcAPc2-intein2-CBD为可溶性蛋白,且融合蛋白约占菌体总蛋白的30.1%,经蛋白质印迹分析确定表达产物是具有CBD蛋白的特异性融合蛋白.融合蛋白AcAPc2-intein2-CBD经几丁质柱高效亲和纯化,并经β-巯基乙醇诱导的独特的在柱自剪切后,得到目的蛋白AcAPc2,经SDS-PAGE分析在21 KD处呈现目的条带,所得的可溶性AcAPc2分子量符合其天然活性的二聚体形式.对AcAPc2表达和纯化工艺上的改进,方便了AcAPc2的获取, AcAPc2氨基酸序列的生物信息学分析初步阐明了AcAPc2的结构和功能的关系,为进一步研究AcAPc2的抗凝血机制及其作为抗凝血药的临床应用奠定了基础.
