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闭合环状DNA文献资料
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低拷贝HBV病毒全长DNA的制备和体外复制水平的鉴定
目的:从乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)低拷贝的血清样本中提取病毒DNA并通过PCR扩增得到全长DNA片段.将全长片段经过环化处理后转染HuH7细胞,体外评价病毒的复制水平.方法:设计含有BspQ I酶切位点的HBV全长扩增引物和分段扩增引物,选择HBV低拷贝的临床病人血清样本,经抽提纯化后的病毒DNA作为模板,用巢式PCR结合分段扩增的方法扩增得到HBV全长DNA,PCR产物经BspQ I酶切后自连环化,将环化的HBV DNA转染HuH 7细胞,经5d细胞培养,提取细胞中的病毒复制中间体,通过Southern blot分析病毒复制水平.结果:通过PCR扩增得到5个HBV全长DNA,经过酶切连接全长基因后转染HuH7细胞,Southern blot检测均有复制表达.结论:本实验成功构建能够有复制表达的HBV环化全长,为研究血清中低拷贝HBV病毒的不同病人复制水平与DNA序列关系打下基础.
