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核糖核酸干扰(RNAi)文献资料
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去泛素化酶USP10RNAi慢病毒载体的构建及其对PC12细胞增殖的影响
目的:构建大鼠去泛素化酶USP10 siRNA重组慢病毒载体,为探讨USP10对神经元的调控作用提供体外模型.方法:设计并合成3对特异性大鼠USP10基因的RNAi靶序列,聚合酶链反应(PCR)扩增后,用AgeⅠ及EcoR Ⅰ双酶切及连接酶构建线性化的GV208慢病毒载体;转化感受态细胞,经Amp抗性筛选阳性克隆,PCR鉴定阳性克隆载体并测序;病毒包装并转染至293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,荧光法检测滴度.用重组慢病毒感染PC12细胞,Westem Blot检测USP10蛋白的表达,CCK-8法检测PC12细胞增殖.结果:经测序鉴定成功构建了3对USP10 RNAi慢病毒载体,感染PC12细胞后,USP10蛋白的表达显著被抑制,PC12细胞的增殖能力明显减弱.结论:成功构建能高效、稳定抑制USP10表达的PC12细胞株,并明显抑制PC12细胞增殖能力,为探讨USP10对神经元的调控作用提供基础.
