首页 > 文献资料
-
重组hIL-12病毒在Sf9细胞传代中遗传稳定性的研究
将含重组白细胞介素12(hIL-12)的杆状病毒(Ac-hIL12)经空斑纯化后,在草地贪夜蛾Sf9细胞中进行连续无稀释传代到P55代,收集被P15、P25、P35、P45、P55代重组病毒感染的细胞,抽提胞内病毒(ICV)DNA.根据重组病毒构建的原理,在P35 cDNA和P40 cDNA的3′末段设计一对引物进行PCR,扩增出了包括P35 cDNA、Polyhedrin启动子、P10启动子和P40 cDNA序列在内的全长约2.0kb片段,克隆至T Vector进行序列测定后发现,在第P15、P25和P35代所扩增出的序列没有发生任何突变.但在P45代,P35cDNA中就有3个碱基发生了点突变(461T→C,517A→G以及630C→T),Polyhedrin启动子的+1位后插入了一个碱基T,P40 cDNA与P10启动子区(230bp)没有变化;而第P55代除了以上碱基突变以外,P10启动子区-168位的G替换突变为T, -136与-135位之间插入一个碱基T,以及-122位缺失一个碱基T.以上结果表明杆状病毒在体外细胞连续传代过程中可导致外源基因本身的突变.
关键词： 人白细胞介素12(hIL-12) 工程病毒 连续无稀释传代 遗传稳定性 -
重组人单链白细胞介素12融合基因(rhscIL一12)的构建和真核表达
目的克隆人IL-12(hIL-12)p40和p35亚单位cDNA，构建人单链IL-12(rhscIL-12)融合基因，并在哺乳动物细胞中进行表达。方法从经PDBu刺激的EBV转化的人B淋巴母细胞株NC37中提取mRNA，经RT-PCR分别获得hIL-12p40和p35亚单位编码序列的cDNA，运用重组PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3 DNA序列进行体外基因重组，构建rhscIL-12融合基因，将其插入pcDNA3.1(+)真核表达载体，经脂质体转染COS7细胞进行表达，Western b1ot进行分析。结果所克隆的hIL-12p40、p35cDNA序列和构建的rhscIL-12融合基因DNA序列均经测序得以证实，融合基因可在COS7中表达其产物rhscIL-12融合蛋白，其分子量为70KD，可与鼠抗人IL-12p40/p70单克隆抗体特异性结合。结论本研究结果为进一步探讨rhscIL-12融合蛋白的生物学活性和特性奠定了基础，也为rhscIL-12融合基因在原核细胞中的表达提供了可能性。
