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胸腺素β4对乙醇诱导的体外兔角膜上皮细胞损伤的保护作用
背景 准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(LASEK)是目前主要的屈光矫正术式之一,但术中使用的乙醇可引起角膜上皮的损伤.胸腺素β4(Tβ4)具有抗凋亡等多种生物学作用,但其对乙醇所致的角膜上皮细胞损伤是否具有保护作用尚不清楚. 目的 研究Tβ4对乙醇诱导的角膜上皮细胞损伤是否具有预防作用.方法 收集10只健康成年新西兰白兔的角膜,采用组织块培养法获得兔原代角膜上皮细胞传代,逆转录PCR(RT-PCR)法检测缝隙连接蛋白connexin 43和成熟角蛋白keratin 12的表达情况,对细胞进行鉴定.选取第2代处于对数生长期的细胞均衡分为4个组,正常对照组细胞进行常规培养,Tβ4组细胞在培养液中添加终浓度为1 μg/ml的Tβ4,乙醇组细胞用含体积分数20％乙醇的PBS作用20 s以制备角膜上皮细胞损伤模型,乙醇+Tβ4组在损伤模型培养液中加入Tβ4.采用MTT法检测各组角膜上皮细胞存活率;采用TUNEL法观察角膜上皮细胞的凋亡情况;采用实时荧光定量PCR法检测各组角膜上皮细胞中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4) mRNA的相对表达量;应用ELISA法检测各组角膜上皮细胞中bcl-2蛋白的质量浓度;用分光光度法检测细胞裂解液中caspase-3酶活性. 结果 MTT法结果显示,正常对照组细胞存活率设定为100％,乙醇组细胞存活率为(52.1±14.07)％,明显低于正常对照组,差异有统计学意义(P=0.001);乙醇+Tβ4组细胞存活率为(77.7±19.60)％,明显高于乙醇组,差异有统计学意义(P=0.035).TUNEL染色显示,乙醇组和乙醇+Tβ4组均可见明显的TUNEL阳性染色细胞,乙醇+Tβ4组阳性细胞百分比为(30.0±6.7)％,明显低于乙醇组的(42.4±4.0)％,差异有统计学意义(P=0.01).实时定量PCR显示,乙醇+Tβ4组细胞中Cyclin D1 mRNA和CDK4 mRNA的相对表达量分别为0.93±0.17和0.88±0.09,均明显高于乙醇组的0.68±0.05和0.54±0.07,差异均有统计学意义(P=0.027、0.002).ELISA显示,乙醇组细胞中bcl-2蛋白质量浓度明显低于乙醇+Tβ4组,而caspase-3酶活性则高于乙醇+Tβ4组,差异均有统计学意义(P=0.030、0.021).结论 Tβ4对乙醇诱导的角膜上皮细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过降低角膜上皮细胞中caspase-3酶活性和增加bcl-2蛋白质量浓度来阻止乙醇所致的细胞凋亡;Tβ4也可上调角膜上皮细胞中Cyclin D1及CDK 4的表达,以调控细胞分裂和增生,促进角膜上皮损伤的愈合.
