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细粒棘球绦虫GAPDH蛋白的生物信息学分析及其重组表达纯化和酶活性检测
目的 以生物信息学预测细粒棘球绦虫甘油醛3-磷酸脱氢酶(EgGAPDH)编码基因及其编码蛋白的结构和功能,利用大肠杆菌原核表达系统高效表达EgGAPDH重组蛋白,体外检测其酶活性.方法 运用各软件对EgGAPDH的理化性质、保守功能域、系统发生树和二级结构、三级结构等方面进行分析后,将EgGAPDH基因亚克隆于表达载体pET30a(+),转化入E.coli BL21(DE3)感受态细菌,表达、纯化重组蛋白,并利用底物3-磷酸甘油醛测定重组蛋白EgGAPDH的酶催化活性.结果 EgGAPDH cDNA序列长度为1 011 bp,编码一个336个氨基酸的蛋白.该GAPDH蛋白理论相对分子质量为36 128.3 Da,等电点为8.44,具有GAPDH蛋白家族的两个功能结构域,富含6种类型的特定功能位点.成功构建的原核表达载体pET30a(+)-EgGAPDH在E.coli BL21(DE3)中高效表达,且发现表达产物主要以可溶形式分布于裂解上清,制备甘油醛3-磷酸脱氢酶纯品并通过酶活检测显示其具有高效酶活性.结论 EgGAPDH基因可在原核系统中获得有酶催化活性的高效表达,为进一步研究其在糖代谢中的功能奠定了基础.
关键词： 细粒棘球绦虫 甘油醛3-磷酸脱氢酶 生物信息学 原核表达 酶活性检测 -
参与糖酵解的酶甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶和丙酮酸激酶是KATP通道大分子复合物的组成成分
ATP敏感的钾离子通道的活性很复杂,受多个因子的调节,重要的是受糖酵解产生的ATP的调节.为了了解细胞内是否存在KATP通道复合物的新的亚基,我们用小鼠KATP通道形成亚基Kit6.2的C端做诱饵蛋白利用细菌双杂交技术对大鼠心脏cDNA文库进行了蛋白质相互作用的筛选.发现参与糖酵解的酶甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和磷酸丙糖异构酶(TPI)能够与Kir6.2相互作用,另外用免疫共沉淀的方法发现丙酮酸激酶(PK)也能够与Kit6.2相互作用,说明这三种酶是KATP通道大分子复合物的组成成分.
关键词： 甘油醛3-磷酸脱氢酶 磷酸丙糖异构酶 丙酮酸激酶 KATP通道 -
死后脾组织mRNA降解程度与死亡时间的关系
目的 探讨小白鼠死后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解情况与死亡时间(PMI)的关系.方法 24只NIH小白鼠断颈处死,置于25℃温控系统内,利用两步法RT-PCR技术和核酸蛋白测定仪定量cDNA方法检测小白鼠脾GAPDH mRNA和β-actin mRNA在死后即刻至72 h降解情况.结果 在25℃温控系统内的小白鼠死后即刻至48 h脾组织均可检测到GAPDH mRNA和β-actin mRNA,且其扩增产物呈规律性下降趋势.结论 小白鼠死亡后脾组织GAPDH mRNA和β-actin mRNA降解程度与PMI负相关,可为PMI推断提供一种新的观测指标.
