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抑癌基因TCF21重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的：利用大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组法构建重组腺病毒pAd-TCF21载体。方法设计TCF21cDNA 扩增引物，从真核表达载体pCMV-SPORT6.1-TCF21中扩增TCF21的DNA序列，与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接，构成穿梭质粒pAdTrack-TCF21；然后再用经PmeI酶线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183，采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-TCF21；筛选同源重组质粒阳性克隆，提取pAd-TCF21质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定。结果线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183，12~20h后获得了40%阳性重组质粒克隆，经酶切获得>23kb的大片段和3.0 kb的特征性片段，PCR反应扩增出了540bp的片段，证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因TCF21。结论细菌内同源重组法成功构建了含TCF21基因的重组腺病毒质粒，为下一步腺病毒介导的TCF21转染A549细胞的研究打下基础。
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细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒
目的:采用细菌内同源重组法高效制备含hp27mt基因的重组腺病毒质粒.方法:hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,构成穿梭质粒pShuttle-CMV/hp27mt;然后再用经PmeI酶切的pshuttle-CMV/hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy-1/hp27mt;筛选同源重组质粒阳性克隆,提取pAdeasy-1/hp27mt质粒经Pac Ⅰ酶切鉴定和PCR鉴定.结果:线性化的pShuttle-CMV/hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态 BJ5183,12-20h后获得了30%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一大于20 kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,PCR反应扩增出了275 bp的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp27mt.结论:用细菌内同源重组法可制备含hp27mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷.为转染293细胞制备高滴度重组腺病毒提供高纯度的重组腺病毒质粒.
