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人内皮抑素突变体文献资料
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对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐的合成及其在重组人内皮抑素中的定点引入
以对硝基-L-苯丙氨酸为原料,通过5步反应制备纯度较高的对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐.利用构建好的重组表达载体和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA(MjTyrRS/tRNA)系统将对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzPhe)定点(31位)引入到人内皮抑素分子中,表达人内皮抑素中突变体——rhEs31m.对分离纯化所获得的目的产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,突变体rhEs31m电泳纯度达90％以上,同时可被抗人内皮抑素抗体特异性识别.通过MTT法检测rhEs31m体外抗人脐静脉内皮细胞增殖活性,结果显示:与野生型rhEs相比,rhEs31m保留了大部分生物活性.本实验表明单个pAzPhe 的定点引入并未破坏重组人内皮抑素的空间结构和生物活性.
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含有对叠氮苯丙氨酸的人内皮抑素的表达及纯化
优化定点引入对叠氮苯丙氨酸的詹氏甲烷球菌属正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统,使用优化后的正交系统在大肠杆菌内表达并纯化在特定氨基酸位点引入对叠氮苯丙氨酸的人内皮抑素突变体.首先将正交酪氨酰1RNA合成酶启动子-15区的TATAA序列突变为TTAA序列,同时将正交酪氨酰tRNA合成酶的第286位天冬氨酸突变为精氨酸以提高对抑制型tRNA反密码子CUA的识别力.然后将质粒pST和pET32a-mhEn转化到大肠杆菌DHI0BDE.,3中得到重组工程茵.该重组菌在含有对叠氮苯丙氨酸的培养基中培养,并经IPTG诱导表达人内皮抑素突变体.利用镍亲和色谱纯化获得人内皮抑素突变体,纯度大于90％.通过对正交酪氨酰tRNA合成酶/tRNA系统的优化,有效提高了系统引入对叠氮苯丙氨酸的效率,人内皮抑素突变体的表达量有了显著提高.
