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整合高拷贝数猪源转录因子的猪胎儿成纤维细胞系的建立
目的:对猪primed胚胎干细胞、囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM)和胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)转录组比较分析,在筛选出ICM中表达水平上调的5个转录因子(OCT4、TBX3、REX1、LIN28及DPPA5)的前期研究基础上,尝试构建具有2A肽(2A peptide)基因序列的转录因子重组表达载体,并与pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,以期获得同时转入5个转录因子的单克隆细胞系,为讨论利用Tet-On 3G诱导表达系统并通过添加盐酸多西环素(doxycycline hyclate,DOX)激活转录因子表达,高效诱导形成猪诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS)的相关研究奠定基础.方法:以PEF细胞cDNA为模板,利用PCR方法扩增获得猪源REX1、LIN28、DPPA5 3个转录因子,并将3个转录因子以E2A和T2A序列连接成三因子片段(RLD),终将三因子片段及商业合成的OCT4和TBX3连接到改造后的诱导表达载体pTRE3G-Zs中,获得3个重组表达载体;利用核转染的方法,将3个重组诱导表达载体与表达反式激活蛋白的pEF1a-Tet3G质粒共转染PEF细胞,并通过药物筛选和鉴定获得单克隆转基因细胞系.结果:扩增获得带有2A肽序列的猪源转录本片段REX1 (975bp)、UN28 (727bp)和DPPA5(408bp),并获得2A肽序列连接成的三因子片段RLD,终构建了3个表达载体(pTRE3G-Zs-OCT4、pTRE3G-Zs-TBX3、pTRE3G-Zs-RLD),且经酶切鉴定证明载体连接正确;3个表达载体与pEF1 a-Tet3G质粒核共转染PEF细胞后,经过药物筛选和外源基因鉴定,共获得同时转入五因子的单克隆细胞系70个,其中29个细胞系外源基因拷贝数较高.结论:成功建立了具有高拷贝数猪源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5 5个转录因子的单克隆转基因细胞系.
