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布鲁杆菌M5-90Δbp26基因缺失株的构建与免疫原性的比较研究
目的 构建布鲁杆菌M5-90Δbp26基因缺失株,对比观察其免疫原性与M5-90亲本株的区别,研制毒力弱、安全性能好并能进行鉴别诊断的布鲁杆菌弱毒候选苗.方法 利用常规分子生物学技术构建布鲁杆菌M5-90Δbp26基因缺失株并进行遗传稳定性检测和常规细菌学性质鉴定；用1.0×109 CFU/2 ml剂量的M5-90亲本株和M5-90Δbp26基因缺失株分别免疫绵羊,所得血清与纯化的BP26蛋白进行Western blot免疫印迹实验,比较M5-90Δbp26基因缺失株与M5-90亲本株在体液免疫中对BP26蛋白识别上的差异；用试管凝集试验(SAT)检测受试绵羊不同时期(0、7、14、21、30、45 d)的血清效价；安全性试验用1.0×106、6.0×106、2.0×107 CFU/0.2 ml的M5-90亲本株和M5-90Δbp26基因缺失株分别免疫接种小鼠,观察、记录小鼠接种疫苗后的临床症状和死亡情况,比较二者的毒力.结果 遗传稳定性检测M5-90亲本株PCR扩增出长度约1279 bp的片段,而2～15代的M5-90Δbp26基因缺失株扩增出长度约629 bp的片段,后者测序结果表明出现bp26基因650 bp的缺失；常规细菌学性质鉴定结果,M5-90Δbp26由M5-90亲本株的单因子血清试验M型转变为R型,BK2噬菌体裂解实验由阳性转变为阴性,鉴定为深度变异菌株；Western blot免疫印迹实验表明M5-90Δbp26基因缺失株免疫绵羊所获得的血清与纯化的BP26蛋白不发生反应,而M5-90亲本株可发生反应；STA试验表明M5-90Δbp26基因缺失株诱导绵羊产生抗体水平(1∶50)明显低于M5-90亲本株(＞1:800)；安全性试验表明M5-90Δbp26基因缺失株毒力比M5-90亲本株明显减弱.结论 成功构建M5-90Δbp26基因缺失株.与M5-90亲本株比较,M5-90Δbp26基因缺失株具有毒力弱、能区分自然感染与疫苗免疫的特点,可作为标记疫苗的候选株.
