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实验性帕金森病中线粒体顺乌头酸酶表达的研究
目的 探讨线粒体顺乌头酸酶(ACO2)在实验性帕金森病(PD)发病中的表达.方法 采用Wistar大鼠6-OHDA右侧内侧前脑束定位注射,制备实验性PD动物模型.在4 w后分别进行假手术组和实验组的纹状体定位分离,脑蛋白质提取,荧光差异双向凝胶电泳(DIGE).通过的DecyderTM分析软件进行蛋白变化比对,其中AV比＞1.2或＜1.2,并且配对t检验P＜0.05为有意义的蛋白点,针对发现的差异表达的蛋白点进行质谱分析.结果 DIGE分析发现表达明显降低的3个差异蛋白质点,经质谱分析确认均为ACO2.结论 ACO2在纹状体的表达明显降低,提示线粒体功能障碍在PD发病过程中发挥重要作用.
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α-OGG1与ACO2蛋白的表达纯化及其相互作用鉴定
[目的]原核表达纯化获得可溶性α-OGG1,ACO2蛋白并初步鉴定其相互作用.[方法]将α-OGG1,ACO2基因构建到pGEX-4T-2-TEV和pET-28a-TEV表达载体上,转化至BL21(DE3)大肠杆菌.IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni柱和GST柱亲和层析法纯化目标融合蛋白;采用SDS-PAGE检测表达产物;采用GST-Pulldown方法鉴定蛋白与蛋白的相互作用;采用双质粒共转化,表达纯化α-OGG1,ACO2蛋白复合体.[结果]成功克隆并构建了α-OGG1及其N-半段、C-半段基因和ACO2基因的原核表达载体,并转化至大肠杆菌表达.通过Ni柱和GST柱亲和层析法得到可溶性表达的6×His_α-OGG1 (1-326)和GST_ACO2(29-780)蛋白,SDS-PAGE检测结果表明2个蛋白条带均与理论大小相符.GST-Pulldown实验结果证实α-OGG1与ACO2直接相互作用.通过共转化、表达纯化得到了α-OGG1与ACO2的复合物.[结论]采用原核表达和亲和层析纯化得到了可溶性6×His_α-OGG1,GST_ACO2融合蛋白及两者的复合体,并初步证实α-OGG1与ACO2存在直接相互作用.
