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人巨细胞病毒UL135蛋白结合蛋白的酵母双杂交筛选
目的 利用酵母双杂交系统从人胎脑cDNA文库中筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL135编码蛋白相互作用的蛋白.方法 将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL135转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL135的酵母细胞中,筛选与HCMV UL135编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 终确认60个克隆与HCMV UL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1高度同源.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用.
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与人巨细胞病毒UL130编码蛋白相互作用蛋白的筛选
目的利用酵母双杂交技术筛选与人巨细胞病毒（HCMV）UL130表达产物有相互作用的细胞蛋白及其编码基因,了解其在宿主基因组中的地位功能。方法将成功构建的酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL130转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA转化到含有pGBKT7-UL130的酵母细胞中,筛选与HCMVUL130编码蛋白相互作用的细胞蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果终确认9个克隆与HCMVUL130编码蛋白相互作用,其中2个克隆与突触小体相关蛋白（SNAP）高度同源。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMVUL130编码蛋白相互作用的蛋白,其中SNAP在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。
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人巨细胞病毒UL145相互作用蛋白的筛选和功能分析
目的 应用酵母双杂交系统筛选与人巨细胞病毒(HCMV)UL145编码蛋白相互作用的来源于人胎脑cDNA文库的组织蛋白.方法 采用聚合酶链式反应扩增HCMV UL145片段,酶切及纯化扩增的目的片段及酵母表达载体pGBKT7,连接HCMVUL145片段及载体pGBKT7,将连接后的重组诱饵表达载体pGBKT7-UL145转化到酵母菌AH109中,再将人胎脑文库DNA也转化到酵母AH109中,筛选与HCMV UL145编码蛋白相互作用的蛋白,并对阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 终确认多个克隆与HCMV UL145编码蛋白相互作用,BLAST结果显示3个与FOXG1高度同源.结论 利用酵母双杂交系统成功筛选出与HCMV UL145编码蛋白相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白FOXG1,推测该目的蛋白在HCMV感染所致神经系统损伤过程中起重要作用.
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人巨细胞病毒UL141编码蛋白相互作用蛋白的筛选和分析
目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV) UL141编码蛋白相互作用的蛋白,以进一步研究HCMV UL141的生物学功能,为揭示HCMV先天感染机制奠定基础.方法 采用PCR技术扩增HCMV UL141基因片段,将其插入到pGBKT7载体中,构建成诱饵质粒pGBKT7-UL141.然后将pGBKT7-UL141转化到酵母感受态细胞AH109中,于一缺培养基(SD/-Trp)上筛选生长.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含有pGBKT7-UL141质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)中筛选相互作用的人胎脑cDNA文库蛋白.通过显色反应挑选显蓝色的阳性克隆,提取相应质粒将其转化到大肠杆菌中,并进行回转验证.后对筛选得到的阳性克隆进行测序及生物信息学分析.结果 诱饵质粒pGBKT7-UL141构建成功.筛选获得6个克隆与HCMV UL141编码蛋白相互作用,其中1个基因编码人类染色质解旋酶DNA结合蛋白3(CHD3).结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL141编码蛋白相互作用的人体组织蛋白—CHD3,提示UL141蛋白可能与病毒的免疫逃避,干扰正常细胞的生长、分化相关.
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筛选与分析与人巨细胞病毒UL133编码蛋白相互作用的蛋白
目的 应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与人巨细胞病毒(HCMV)UL/b′ UL133编码蛋白相互作用的蛋白,为研究UL/b′编码蛋白的生物学功能,揭示HCMV先天感染的致病机制奠定基础.方法 设计特异性引物,在引物上下游分别引入NdeⅠ和BamHⅠ限制性内切酶识别位点,采用PCR技术扩增 HCMV临床分离株H株的UL133基因片段,将其扩增产物与载体pGBKT7 同时使用NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切,纯化后,将UL133片段插入到pGBKT7载体上,构建诱饵质粒 pGBKT7-UL133,并测序分析.利用醋酸锂小量酵母转化方法,将测序正确的诱饵质粒pGBKT7-UL133转化入AH109酵母感受态细胞中,然后将转化的菌液涂布在色氨酸缺陷型培养基(-Trp)上,筛选阳性菌落.再将人胎脑cDNA文库质粒转化到含pGBKT7-UL133质粒的AH109菌株中,在四缺培养基(-Ade/-His/-Leu/-Trp)中筛选,在铺有X-Gal的滤纸上进行显色反应,提取显蓝色的阳性酵母筛选质粒,运用电穿孔方法将其转化到TG1的大肠杆菌中,并行PCR鉴定,提取大肠杆菌中的文库质粒,并将其回转到含诱饵质粒pGBKT7-UL133 的酵母菌株中,进行回转验证.对筛选到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果 用于酵母双杂交筛选的诱饵质粒pGBKT7-UL133成功构建,含有诱饵质粒的酵母菌株在-Trp上生长.转化有人胎脑cDNA文库和诱饵质粒pGBKT7-UL133的酵母菌AH109,在四缺培养基中观察到有28个酵母菌落生长,通过显色反应、酵母质粒转化及回转酵母细胞筛选得到4个阳性克隆.通过序列比对,发现在这些基因中,其中一个基因编码人类还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依赖性氧化还原酶1.结论 成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL/b′区UL133编码蛋白相互作用的蛋白-NADPH,提示UL133蛋白可能在增加病毒毒力和传染性,干扰细胞间的信号传导和细胞的生长、分裂、凋亡等方面发挥重要作用.
