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白细胞介素10.腺病毒载体文献资料
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SD大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定术
背景:重组腺病毒质粒的构建是重组腺病毒制备过程中的中枢环节,传统的细胞内同源重组法步骤多、成功率低、实验周期长.目的:构建含有大鼠白细胞介素10(rlL-10)基因的重组复制缺陷型腺病毒Ad.rlL-10,为真核表达及其动物模型的研究提供实验基础.设计、时间及地点:开放性实验,于2005-07/2006-04在中山大学附属第一医院完成.材料:SD大鼠1只.AdEasy系统由美国John Hopkins肿瘤研究中心惠赠.ThermoscriptTMRT kit 和Trizol 为Invitrogen产品;HEK-293保存于中山大学动物实验中心细胞库;克隆大鼠白细胞介素10基因引物合成及测序由上海博亚生物技术有限公司完成.方法:采用反转录聚合酶链反应的方法从健康SD大鼠脾脏新鲜组织中提取的总RNA中克隆rIL-10基因,采用AdEasy-1腺病毒载体系统经E.CoilBJ5183细菌内同源重组及HEK.293包装而获得重组腺病毒Ad.rlL-10.主要观察指标:用Western blot和RT-PCR的方法鉴定Ad.rlL-10并进行滴度测定.结果:自健康SD大鼠脾脏组织中克隆rIL-10基因,构建出重组腺病毒Ad.rlL-10.经PCR扩增、酶切鉴定、DNA 测序终确定插入序列为rlL-1 0,Western blot和RT-PCR均检测出细胞内rlL-10基因及其蛋白表达.再通过扩增、纯化后获得滴度为1.0x1014pfu/mL的重组腺病毒.结论:采用AdEasy-1系统,经细HEK-293细胞包装、扩增,纯化后获得足够数量和质量的病毒,方法简便易行,结果稳定可靠.
关键词： 白细胞介素10.腺病毒载体 基因疗法
