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人毛囊干细胞构建组织工程表皮实验分析
目的：总结人毛囊干细胞构建组织工程表皮实验方法，并分析体外构建人毛囊干细胞对皮肤缺损的影响。方法：分离培养毛囊角质细胞，并制备体外构建表皮膜片，同时选取12只裸鼠进行皮肤缺损修复处理，采用制备的毛囊干细胞壳聚糖明胶膜片对裸鼠创面进行覆盖，同时选取12只裸鼠进行皮肤缺损处理，仅采用壳聚糖明胶膜片覆盖固定，比较其效果。结果：术后1周修复组大鼠创面干燥并可见新生上皮，而空白材料对照组大鼠创面仍未愈合；回植后1个月，修复组大鼠无显著收缩现象明显优于对照组（P＜0．05）；且修复后1周，修复组大鼠创面可见新生上皮，且表皮分化良好明显优于对照组（P＜0．05），且两组大鼠经 HE染色检测显示均有复层表皮结构，但修复组大鼠创面表皮层层次较多，且厚度明显优于对照组大鼠。结论：体外构建人毛囊干细胞有利于促进皮肤缺损恢复，临床价值显著，值得推广应用。
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人毛囊干细胞分离培养与鉴定方法的研究
目的 实现毛囊干细胞的高效快速分离.方法 将人头部皮肤标本显微分离毛囊隆突区组织由中性蛋白酶消化后,将其直接接种于Matrigel包被的培养板中培养.细胞迁出后,待细胞融合达到60％ ～ 70％时,传代培养.取传代培养4周的人毛囊干细胞进行流式细胞学分析及克隆形成能力测定,鉴定毛囊干细胞的表型及增殖潜能.结果 分离培养所得毛囊干细胞呈铺路石样生长,细胞胞体较大,细胞核大而明显,具有较高的核质比,干细胞细胞学特征明显.流式细胞仪鉴定毛囊干细胞表面标记物Lgr5阳性率为84.02％,Lgr6阳性率为66.32％.细胞增殖能力及克隆形成能力测定结果显示,毛囊干细胞具有较强的增殖潜能,可由单细胞生成明显的克隆集落.结论 本研究通过显微解剖结合消化法,实现了人头皮毛囊干细胞的高效快速分离培养.采用显微分离培养获得毛囊隆突区细胞,细胞表型分析证实其Lgr5及Lgr6阳性干细胞比率、细胞形态、细胞周期及克隆形成能力均符合干细胞特性.
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人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达
目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.
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人毛囊干细胞Notch信号通路阻滞作用研究
目的 研究Notch信号通路阻滞对人毛囊干细胞增殖分化的调节作用. 方法 收集2012年1月-2013年12月整形外科手术残留的头部皮肤组织,通过显微分离结合酶消化法分离人毛囊隆突区细胞,应用不同浓度的Notch信号通路阻滞剂DAPT处理后,观察对细胞的克隆形成能力、细胞周期及细胞凋亡,并进行分析. 结果 Notch信号阻断后,对人毛囊干细胞的增殖、分化及凋亡具有一定的调节作用,其中20 μmol/L药物处理组克隆形成率提高到(84±12)％,细胞总凋亡比例下降为3.81％.Western blot结果示N1ICD、Hes1及p21表达均有降低,Wnt-10b的表达上调. 结论 Notch信号通路阻滞剂DAPT能有效提高人毛囊干细胞比例,减少细胞凋亡,其调节机制可能与其对p21表达的调控以及与Wnt通路的交互作用有关.
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齐墩果酸对体外培养人毛囊干细胞增殖的影响
目的:探究齐墩果酸对人毛囊干细胞增殖活性的影响.方法:取术中毁弃的人全层头皮标本,使用两步酶消化法分离提取毛囊干细胞进行体外培养,运用免疫荧光K15染色鉴定;将细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板,培养液中分别加入1×10-4、1×10-3、1×10-2、0.1、1 μg/ mL梯度浓度齐墩果酸,于处理的24 h及48 h使用MTT法检测毛囊干细胞活性.结果:获得的毛囊干细胞呈典型的铺路石状生长,免疫荧光K15阳性,阳性率为(86.7±5.2)% (n=4).与空白组相比,1×10-4μg/mL及1×10-3μg/mL齐墩果酸处理组在24 h及48 h的OD490均有明显升高(P<0.05).结论:齐墩果酸能够促进体外培养的人毛囊干细胞增殖.
