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经穿膜肽与PEG修饰的核糖体失活蛋白Gelonin抗肿瘤作用的研究
目的:通过对核糖体失活蛋白Gelonin进行化学修饰,利用穿膜肽和聚乙二醇(PEG)偶联来提高其到达肿瘤部位和进入肿瘤细胞的能力,使Gelonin更高效地发挥抑瘤作用. 方法:利用FPLC Superdex75分子筛预装柱纯化系统对所修饰的Gelonin进行纯化后,在不同细胞系测试细胞毒性;通过倒置荧光显微镜、流式细胞分析技术等对药物进入纤维肉瘤细胞HT1080的能力进行评价;采用小动物活体成像技术考察药物体系在荷瘤动物体内的分布情况. 结果:采用分子筛色谱纯化可以得到纯度相对较高的修饰产物,其毒性较无修饰的Gelonin强,且在HT1080细胞系作用明显;细胞摄取结果显示,与未修饰的Gelonin相比,该药物体系具有更高的细胞摄取效率;动物成像结果表明,PEG5000修饰可以改变Gelonin在动物体内的分布情况,增加在肿瘤的药物蓄积.结论:穿膜肽和PEG5000修饰后的Gelonin有较高的肿瘤细胞摄取和杀伤能力,药物在肿瘤的蓄积量较高,从而增强了药物的抑瘤效果.
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细胞毒素Gelonin的亚克隆、表达与纯化
将分别含有细胞毒素gelonin基因片断的重组子pUC-gell和pUC-gelⅡ,按照预先设计的酶切位点,通过亚克隆得到含有gelonin全基因的重组子pUC-gel.然后将pUC-gel与pET28a同时用NdeI/EcoRI双酶切,相关片段构建成表达重组子pET-gel,并进行DNA序列测定.工程菌E.coli B121/pET-gel表达产物经两步SP-Seph-rose柱层析,可得电泳纯的重组gelonin,分子质量为28000 u.无细胞体系蛋白质合成实验表明,其IC50(使蛋白质合成抑制50%所需浓度)为35μg/xg/L.酶联免疫实验为阳性.
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抗EGFR单链抗体融合gelonin毒素的原核表达体的构建及其生物活性研究
目的 构建表达抗表皮生长因子受体(EGFR)单链抗体融合gelonin毒素的原核表达载体,并初步验证其功能.方法 以抗EGFR单链抗体基因为模板,通过PCR及酶切连接将该基因定向克隆人含gelonin毒素的原核表达载体pET32a中,将该质粒转入BL21( DE3)中经异丙基疏代半乳糖苷(IPTG)诱导表达得到包涵体,通过变性、复性并进行阳离子交换层析得到较纯的目的蛋白（重组免疫毒素rEG蛋白）.对纯化的rEG蛋白用Westernblot检测其免疫学特性,用细胞免疫组化实验及MTT实验测定其靶向性及生物学活性.结果 经酶切及测序证实重组质粒pET32a-rEG构建成功.诱导得到的包涵体经变性、复性后使用阳离子交换层析而纯化得到rEG蛋白.纯化的rEG蛋白经Western blot鉴定,可以与兔抗gelonin血清特异性结合.经细胞免疫组化实验鉴定,rEG蛋白可以有效靶向EGFR阳性细胞,MTT实验也证实纯化的rEG蛋白能特异性抑制EGFR阳性表达的肺腺癌A549细胞的生长.结论 成功制备了高纯度、具有生物学活性的rEG免疫毒素,为进一步研究其生物学功能提供了条件及基础.
