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细胞示踪影像学技术的发展
随着细胞治疗的不断深入,采取有效的活体细胞示踪技术评价细胞治疗后的疗效并监测移植细胞的分化增殖、迁移及生存状况,对细胞治疗后脏器功能改善机制的深入研究及指导未来细胞治疗的临床应用显得尤为重要,因此活体细胞示踪成像技术成为细胞治疗由基础研究到临床应用推广的关键技术之一.笔者主要就当前细胞示踪影像技术(主要是MRI及光学成像)的发展及其可行性作一综述.
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腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞
目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据.方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1、3、5、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率.MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响.结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持.MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义.结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响.
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烟曲霉钙调蛋白的红色荧光蛋白标记及其在菌株极性生长的动态分布
目的 构建自身启动子调控、含有红色荧光蛋白(RFP)标记的钙调蛋白烟曲霉菌株,观察菌株生长过程中钙调蛋白的动态分布.方法 设计烟曲霉钙调蛋白基因的两端侧翼序列,对两序列及含有RFP-烟曲霉pyrG营养标记(mRFP-AfpyrG)的质粒分别进行PCR扩增,再通过融合PCR对上述3个片段进行整合,形成转化用的线性片段.随后采用原生质体转化法将上述片段转入烟曲霉受体菌株中,构建钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株.在营养筛选培养基平板上挑取单克隆菌落培养,选取荧光表型稳定的单菌菌落对其转化子进行PCR验证.将重组菌株和野生菌株分别接种于固体营养培养基中,培养不同时间后荧光显微镜下观察菌株形态学差异.将上述两株菌分别接种于液体培养基中,甲基四氮盐(xTT)方法观察其生长活力差异,并对红色荧光标记菌株进行动态活体观察,分析钙调蛋白在烟曲霉生长发育过程中的时空分布.结果 重组菌株的荧光表型及转化子的PCR鉴定结果表明,钙调蛋白-RFP烟曲霉菌株构建成功.重组菌株与野生菌株在24 h时生长活力(A490值)分别为0.689±0.081和0.678±0.054(t=1.32,P＞ 0.05),差异无统计学意义,且形态学方面也无显著差异.钙调蛋白在烟曲霉生长过程中始终处于极性生长过程中的菌丝顶端、分枝出芽点及新形成的分枝顶端.结论 钙调蛋白可能参与调控烟曲霉孢子萌发及菌丝极性生长等重要生物学过程.
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Ad-GFP基因经半规管转导对豚鼠内耳形态和功能的影响
目的:探讨经半规管途径转导豚鼠内耳基因的可行性,绿色荧光蛋白的表达及其对内耳形态和功能的影响.方法:采用白色红目健康纯种豚鼠24只,将缺陷型腺病毒携带的绿色荧光蛋白基因5μl经显微手术自前半规管灌入豚鼠内耳,同法注入人工外淋巴液5μl作对照,另一组经圆窗膜注入5μl Ad-GFP基因,分别在手术后7、14、21、28d处死,0.5%硝酸银灌注耳蜗基底膜铺片显微镜观察内外毛细胞缺失,全耳蜗铺片荧光显微镜观察GFP表达.基因导入前后及处死前测定脑干诱发电位.结果:实验组耳蜗铺片内外毛细胞缺失计数和对照组无统计学意义;荧光显微镜下见术侧半规管、前庭、耳蜗均有荧光表达,术后7d表达强,以后减弱,术后28d还有表达;经半规管组前庭区表达强于耳蜗区,主要分布在前庭及外淋巴间隙;经圆窗组耳蜗区表达强于前庭区.对侧耳蜗及对照组动物呈阴性表达.手术前后脑干诱发电位差异无显著性.结论:经半规管转导基因主要分布在前庭器官及外淋巴间隙,对耳蜗功能影响不大,是一种可行的途径;腺病毒载体携带的基因表达有一定的时间性.
