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HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物
目的 建立HPLC-MS法同时测定六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物(和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基)的方法.方法 采用ODS-2(250 mm× 4.6mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.15％磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,体积流量1 mL/min,柱温40℃,检测波长296 nm.HPLC-MS联用的色谱条件与HPLC分离基本条件一致,流动相为乙腈-0.2％甲酸水溶液.通过电喷雾离子源,正离子模式扫描,对六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物进行分析鉴别.结果 9种蟾蜍二烯内酯类化合物均得到良好分离,线性关系良好(r≥0.999 6).加样回收率均在92％～105％,RSD＜5％.应用建立的HPLC-MS方法测定了10批六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物的量,分别为和蟾蜍他灵0.40～0.88 mg/g,沙蟾毒精0.32～0.83 mg/g,远华蟾毒精0.61～2.11 mg/g,去乙酰华蟾毒它灵0.15～0.32 mg/g,蟾毒它灵0.84～1.85 mg/g,华蟾毒它灵25.76～62.14 mg/g,蟾毒灵0.96～2.06 mg/g,华蟾酥毒基2.30～4.75 mg/g,脂蟾毒配基1.20～2.61 mg/g.结论 所建立的定量测定方法简便、快速、准确可靠,专属性强,可用于六神丸的质量控制.
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蟾酥干燥炮制前后化学成分和药效学变化考察
目的 考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化.方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果.结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6％;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果.结论 日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状.真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化.
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远华蟾毒精对小鼠乳腺癌细胞侵袭的抑制作用及机制
目的 探讨远华蟾毒精对小鼠乳腺癌细胞侵袭的抑制作用及其机制.方法 将培养好的小鼠乳腺癌细胞4T1随机分为A、B、C、D组.A组常规培养;B、C、D组于缺氧条件下(37℃、5％ CO、95％N2)进行培养,同时C、D组分别加入0.1、0.5 μmol/L远华蟾毒精进行培养.培养0、6、12、24 h采用划痕实验检测细胞迁移能力(迁移距离),用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力(穿膜细胞数),用Western blotting法检测细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)蛋白表达.结果 不同时点细胞迁移距离D组＜C组＜B组＜A组,穿膜细胞数D组＜C组＜B组＜A组,HIF-1α、MMP-9、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量D组＜C组＜B组＜A组,以上指标两组间比较差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 远华蟾毒精可能通过PI3K/AKT通路降低小鼠乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-9的表达,从而抑制细胞侵袭.
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远华蟾毒精对体外乳腺癌4T1细胞上皮间质转化的影响
目的 观察远华蟾毒精对乳腺癌细胞4T1迁移、侵袭及上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,并研究其相关机制.方法 将鼠乳腺癌细胞系4T1细胞与不同浓度远华蟾毒精(0、0.05、0.1、0.5、1、1.25和1.5μg/ml)分别培养24 h后,MTT试验检测远华蟾毒精对4T1增殖活性的影响;将实验分为对照组(0μg/ml)和实验组(0.05、0.5μg/ml),细胞划痕实验和Transwell实验检测对照组(0μg/ml)和实验组(0.05、0.5μg/ml)对细胞迁移、侵袭能力的影响;免疫荧光检测对照组(0μg/ml)和实验组(0.5μg/ml)上皮间质转化相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤维链接蛋百(Fibronectin)相关蛋白的变化;蛋白质印迹法检测对照组(0μg/ml)和实验组(0.05、0.5μg/ml)上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、转录因子Snail以及PI3k/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR表达的变化.结果 MTT试验结果显示,低浓度远华蟾毒精(0、0.05、0.1、0.5和lμg/ml)对4T1增殖无抑制作用,高浓度远华蟾毒精(1.25和1.5μg/ml)对4T1增殖有抑制作用;细胞划痕实验结果显示,对照组与实验组细胞迁移率差异均有统计学意义(P＜0.05);Transwell迁移实验结果显示,对照组与实验组穿至下室的细胞数差异均有统计学意义(P＜0.05);Transwell侵袭实验结果显示,对照组与实验组穿至下室的细胞数差异均有统计学意义(P＜0.05);免疫荧光结果显示,实验组与对照组相比,E-cadherin表达增强,Vimentin和Fibronectin表达减弱(P＜0.05);蛋白质印迹法结果显示,E-cadherin表达上调,Vimentin和Fibronectin表达下调(P＜0.05);转录因子Snail表达下调(P＜ 0.05);PI3k/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR表达下调(P＜0.05).结论 远华蟾毒精通过Akt/mTOR/Snail信号通路抑制乳腺癌的迁移、侵袭及上皮-间质转化,为远华蟾毒精的临床应用提供了理论依据.
