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VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达
目的 构建VEGF基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达.方法 根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性.结果 测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功.慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109 TU/mL.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%.结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达.
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针对人STAT1基因的RNA干扰有效靶点的设计与筛选
目的:设计并筛选针对人STAT1基因有效的RNA干扰靶点.方法:根据人STAT1基因序列,设计3个干扰序列,将oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5a,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-time PCR检测干扰效果.结果:测序证实3个STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48 h后,STAT1基因在mRNA水平表达均受到抑制,其中MHCC9-L-stat1-shRNA-1序列效果佳,对STAT1基因表达的干扰效率可达81.4％.结论:成功构建并筛选了人STAT1基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究STAT1基因与抗肿瘤药物药效关系奠定基础.
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STAT1干扰慢病毒载体的构建及其基因沉默效应测定
目的:构建STAT1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并测定其基因沉默效应.方法:根据人STAT1基因序列,设计干扰序列,将Oligo退火成双链并连接穿梭载体pLKO-1-EGFP-puro-shRNA,构建shRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5 α,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒.慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L的STAT1过表达瘤株(MHCC97L-stat1),用Real-time PCR和Westem Blot检测RNAi组(MHCC97L-stat1-shRNA-1)和对照组(MHCC97L-stat1)中STAT1基因的表达情况,确定其干扰STAT1表达的有效性.结果:测序证实慢STAT1基因RNAi病毒载体质粒构建成功;慢病毒载体经293T细胞包装成功;慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株48h后,STAT1基因在mRNA水平和蛋白质水平上表达明显降低.结论:STAT1基因RNAi慢病毒载体构建成功,能够在人肝癌细胞MHCC97L-stat1瘤株中表达,并具有显著的基因沉默效果.
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人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选
目的:设计并筛选人血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段,构建VEGF慢病毒表达载体.方法:对人VEGF基因编码区分析,筛选序列3条,阴性对照序列1条,通过连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证.在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度.幔病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测干扰效果.结果:测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功.慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度分别为3.23×109、3.30×109、3.73×109 TU/mL.3个慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L后,VEGF基因在mRNA水平受到抑制,其中miR-200序列效果佳,对VEGF基因表达的干扰效率可达72％.结论:成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点,为进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础.
关键词： 慢病毒载体 血管内皮生长因子基因 RNA干扰 MHCC97L细胞
