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慢性HBV感染患者bcp/pc区点突变模式、pres区缺失及其临床意义
目的 阐明HBV(hepatitis B virus,HBV)感染患者不同临床阶段bcp/pc(basic core promoter,BCP/precore,PC) 点突变模式及pres区缺失突变规律,并探讨其临床意义.方法 慢性HBV感染患者180例,其中,无症状HBV携带者13例,慢性乙型肝炎者75例,HBV相关肝硬化及肝癌分别为62、30例.Qiagen法提取血清HBV-DNA,常规PCR扩增目的基因,纯化PCR产物ABI377DNA自动测序仪直接双向测序.直接测序失败者,回收目的DNA与PMD-18T载体连接,克隆质粒双向测序.DNAStar软件包的SeqMan软件进行生物信息分析.结果 Bcp/pc区点突变包括nt 1753、nt 1762 、nt 1764 、nt 1776 、nt 1803、nt 1846 、nt 1896.HBV携带者、慢性乙型肝炎、HBV相关肝硬化及肝癌患者nt 1762(nt 1764)点突变率分别为 7.7%、68.0%、72.7%(68.0%)及90.9%(81.8%),肝癌患者G1896A突变频率占54.6%.A1762T+G1764A联合突变占36%;A1762T、G1764A、G1896A联合突变占11%;T1753A/C、A1762T、G1764A、G1896A发生率为7%.克隆测序显示,肝硬化及肝癌患者bcp区起始点A1727G点突变率分别为72%、63%.HBeAg阴性患者存在更多的基因变异(P=0.022),G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素(P<0.05).Bcp区点突变与HBeAg阴性无明显关系.肝硬化和肝癌患者pres基因缺失突变频率高,肝癌及肝硬化患者pres1、pres2及pres1+s2缺失频率分别为7.1%、71.4%、7.1% 及41.2%、58.8%、29.4%(P<0.05).结论 A1727G、A1762T、G1764A及A1762T/G1764A联合突变、pres缺失在HBV相关肝硬化及肝癌患者多见,可能是肝脏疾病进展的危险因素,G1776A和G1896A突变是HBeAg阴性的独立预测因素.Bcp/pc点突变及pres区缺失可能为肝癌发生的早期预测因素,值得进一步研究.
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S768I及其相关联合突变在非小细胞肺癌治疗中的研究进展
非小细胞肺癌为肺癌常见的分类.针对非小细胞肺癌患者的分子靶向治疗已发展十余年,现今其已逐渐成为拥有敏感基因突变患者的一线治疗.在研究中发现,除常见经典突变以外,某些罕见突变及其相关联合突变仍可能与对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的敏感性相关.文中主要综述了近年S768I突变及其相关联合突变在非小细胞肺癌治疗中的研究进展.
关键词： 非小细胞肺癌 S768I 联合突变 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 -
云南省恶性疟原虫氯喹及青蒿素抗性相关基因的联合突变分析
目的 分析云南省恶性疟原虫抗氯喹转运蛋白(Hasmodium falciparum chloroquine resistant transporter,Pfcrt)基因和青蒿素抗性相关(K13)基因的联合突变特性.方法 收集2012年8月-2015年12月寄生虫病防治信息管理系统登记和报告的云南省恶性疟病例滤纸血样和流行病学史等相关信息,提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt基因exon2区和K13基因kelch结构域并测序,测序序列与2655199、PF3D7_1343700参比序列进行比对,用MEGA 5.04、Arlequin 3.01软件分析Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域的单倍型、单倍型间期望杂合度(He)及其群体间的遗传分化指数(Fst)等,用Network 4.6.0软件制作单倍型中介网络进化图,采用Epi Data 3.1软件建立数据库,SPSS 21.0统计学软件进行数据分析.结果 共收集恶性疟病例血样234份,Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域巢式PCR扩增产物同时成功测序192份.其中,云南省本地感染病例血样12份,自非洲、缅甸感染的病例血样分别为30和150份.218份血样的Pfcrt基因exon2区DNA序列有7种单倍型,He为0.2385,错义突变序列占83.0％ (181/218),72～76位点呈单重突变(CVMNT)、双重突变(SVMNT)、三重突变(CVIET)的比例分别为1.8％ (4/218)、6.4％ (14/218)和74.8％ (163/218),7种单倍型以氯喹敏感型CVMNK为起始,再按单重、双重及三重突变的路径逐步进化.192份血样的K13基因kelch结构域DNA序列有21种单倍型,He为0.0449,错义突变序列占35.9％ (69/192),在16、446、676等9个位点均只发生单重突变,F446I的突变率高,为25.0％ (48/192),21种单倍型的中介网络图显示“星状”布局.云南省本地恶性疟原虫种群与缅甸种群间的Fst小,为0.0203.Pfcrt基因的氯喹敏感型CVMNK血样中,K13基因kelch结构域位点突变的比例为20.6％ (7/34),氯喹抗性型CVMNT、CVIET血样中的检出比例分别为1/4和36.4％ (51/140).结论 云南省疫情报告病例中恶性疟原虫的氯喹、青蒿素相关抗性基因的联合突变率为27.1％,且青蒿素抗性基因突变型之间可能存在种群扩张模式.
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Asn291Ser和Lys312insC联合突变脂蛋白脂酶蛋白功能研究
通过脂蛋白脂酶基因敲除杂合子(LPL~(+/-))小鼠体内实验.探讨Asn291Ser和Lys312insC联合突变(Asn291Ser+Lys312insC)脂蛋白脂酶的功能改变.结果示LPL~(+/-)小鼠甘油三酯、游离脂肪酸、血糖、体重均较c57小鼠高(均P<0.05),而其肝脏、骨骼肌及脂肪脂蛋白脂酶mRNA表达较c57显著降低(P<0.01),Western印迹实验进一步显示LPL~(+/-)小鼠各组织脂蛋白脂酶蛋白表达较c57低.注射Asn291Ser+Lys312insC脂蛋白脂酶后血脂及脂蛋白脂酶活性变化不明显,而注射野生型脂蛋白脂酶后小鼠游离脂肪酸、甘油三酯显著降低(P<0.05).本研究证实Ash291Ser+Lys312insC联合突变的脂蛋白脂酶活性降低,调脂功能受损.
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乙肝病毒核心启动子A1762T/G1764A/T1753A/T1768A突变对细胞细胞核增殖抗原、核因子-κB和p21表达的影响
目的 通过基因合成A 1762T/G1764A/T1753A/T1768A联合突变后的核心启动子,再以慢病毒感染的方式转染L-02细胞株,观察细胞内细胞核增殖抗原(Ki-67)、核因子-κB (NF-κB)和p21表达的变化.方法 通过基因合成的方法,合成A1762T/G1764A/T1753A/T1768A联合突变后的核心启动子,在N末端加上乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)-Flag标记序列,分别双酶切pLenO-RTP载体和pUC57-CM-HBX,纯化酶切产物后进行定向连接,得到重组质粒pLenO-RTP-CM-HBX.钙转法将重组质粒转入293T细胞进行病毒包装然后转染L-02细胞株.Western blot法检测HBX-Flag在慢病毒感染后L-02中的表达以及转染后细胞内Ki-67、NF-κB、p21的表达.结果 构建pLenO-RTP-CM-HBX核心启动子慢病毒载体可以效率较高地感染L-02细胞株(＞95％),并在细胞内转录、翻译、合成HBX-Flag.突变组Ki-67、NF-κB、p21的相对表达水平分别为2.103±0.346、2.201±0.486、0.771±0.338,空载组为0.221±0.016、0.232±0.117、2.032±0.215,空白对照组为0.323±0.017、0.334±0.207、2.141±0.305.同空载组和空白对照组比较,突变组Ki-67、NF-κB表达增加,p21表达降低(P＜0.05).而空载组和空白对照组的各指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 乙肝病毒核心启动子联合突变可影响细胞内Ki-67、NF-κB和p21的表达.
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联合位点突变的乙肝病毒核心启动子转染L-02及对细胞增殖能力的影响
目的 通过基因合成A1762T/G1764A/T1753A/T1768A联合突变后的核心启动子(CM-HBX),再以慢病毒感染的方式构建稳定表达核心启动子的L-02细胞株,建立肝癌发生的细胞模型.方法 通过基因合成的方法,合成A1762T/G1764A/T1753A/T1768A联合突变后的核心启动子,在N末端加上标记序列HBX-Flag,分别双酶切pLenO-RTP载体和pUC57-CM-HBX,纯化酶切产物后进行定向连接,得到重组质粒pLenO-RTP-CM-HBX.钙转法将重组质粒转入293T细胞进行病毒包装然后转染肝细胞.噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞增殖能力的变化,Western blot法检测HBX-Flag在慢病毒感染后L-02中的表达以及转染后细胞内S期激酶相关蛋白2(Skp2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、p21、p53的表达的变化.结果 构建pLenO-RTP-CM-HBX核心启动子慢病毒载体可以效率较高地感染L-02(＞95％),并在细胞内转录、翻译、合成HBX-Flag,随着培养时间的延长,红色荧光强度无明显变化；同空载组和空白对照组比较,联合突变组L-02的增殖能力明显增强(P＜0.05),Skp2、PCNA表达增加,p21、p53表达降低(P＜0.05).而空载组和空白对照组的各指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 慢病毒载体pLenO-RTP-CM-HBX核心启动子成功转染L-02,转染后的L-02具有癌变倾向.
