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大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定
目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白的预苯酸脱氢酶(PDH),为研究T蛋白双功能结构域CM和PDH的相互协同作用以及T蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料.方法利用pGEX高效融合表达系统将PDH与谷光甘肽疏基转移酶(GST)编码序列在表达宿主BL21实现高效表达,并利用对GST具有亲和作用的Glutathione Sepharose4B琼脂糖珠进行亲和层析以对其分离纯化.结果表达产物达菌体总蛋白的40％,可溶性目的产物得量为240 mg·L-1,利用亲和层析法纯化后纯度达92.5％,GST-PDH融合蛋白的PDH的比活为38 U·mg-1.结论本法成功构建高效表达PDH菌株,表达量高,纯化度高,GST-PDH酶活性正常,为进一步研究奠定基础.
关键词： T蛋白 预苯酸脱氢酶 谷光甘肽巯基转移酶融合表达 酶活性 -
大肠杆菌T蛋白的高效表达和分离纯化
目的构建高效表达菌株,以大量表达大肠杆菌T蛋白,为后续的新药作用靶点研究提供活性蛋白质材料.方法利用高效表达质粒pET26b+克隆了大肠杆菌TyrA基因,并在其C端融合了一个由6个组氨酸组成的his-tag以利分离纯化.结果 T蛋白的表达量达每1 L培养液200 mg,细胞裂解液经一次his-tag亲和柱色谱,纯度达98%,分支酸变位酶和预苯酸脱氢酶的比活性分别为130和98 U*mg-1.结论本法表达的大肠杆菌T蛋白,表达量高,纯化容易,酶活性正常,为进一步研究T蛋白的结构与功能,并进行新药设计奠定了基础.
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大肠杆菌T蛋白的调节结构域的定位分析
目的:分析大肠杆菌T蛋白是否拥有独立的调节结构域,并确定其在氨基酸序列上的定位.方法:利用分段克隆法克隆了11个大肠杆菌T蛋白的片段,检测各片段的调节活性.结果:发现大肠杆菌T蛋白的调节结构域定位于C末端约270个氨基酸,并与其预苯酸脱氢酶结构域密不可分.结论:大肠杆菌T蛋白没有独立的调节结构域.
